Este projecto foi apoiado pelo NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 e Dept. de ciências clínicas divulgação fundos

Para estas experiências, todos os estudos em animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade Estadual da Carolina do Norte.
1. preparação para cultura
Nota: Todos os reagentes estão listados na Tabela de materiais. Concentrações de fator de crescimento específicos estão listadas na tabela 1.
<ol><li>Prepare uma solução de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M em água destilada, deionizada (ddH2O). Misture adequadamente e ajustar o pH para 7,4 usando soluções de NaOH ou HCl. Nota: Compõem a solução estoque de EDTA fresco antes de cada experimento.</li>
	<li>Preparar o reagente de dissociação #1 (DR #1) da seguinte forma e colocar no gelo: tampão fosfato combinam salino sem Ca2 + e Mg2 + (PBS), 0,5 M de EDTA, 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT), 10 µM Y27632 e 1 solução X antibiótico-antimicótico (anti-Anti) contendo penicilina, estreptomicina e anfotericina b. Nota: Adicione Y27632 imediatamente antes da coleta de tecido.</li>
	<li>Preparar o reagente de dissociação #2 (DR #2) da seguinte forma e coloque em banho maria a 37 ° C: combinar PBS sem Ca2 + e Mg2 +, EDTA 0,5 M, 10 µM Y27632 e 1 X anti-Anti. Nota: Adicione Y27632 imediatamente antes da coleta de tecido.</li>
	<li>Preparar a mídia de células-tronco epiteliais intestinais (Iguatemi) como segue: Mix 25 mL avançado meio DMEM/F12 com 1 suplemento N2 X, 1 X B-27 suplemento, 10 mM HEPES, 2mm Glutamax e 1 X anti-Anti. Armazenar a 4 ° C até o uso.</li>
	<li>Preparar uma mistura mestre de fator de crescimento reduzido da membrana basal matriz (matriz) e fatores de crescimento suplementares da seguinte forma: descongelar a matriz no gelo. Em um tubo de microcentrifugadora, adicionar 100 ng/mL Noggin humana recombinante, 500 ng/mL recombinante humana R-Spondin 1, 50 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a humana recombinante, 10mm nicotinamida, 10 gastrina nM, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , SB202190 de 10mm, 500 nM LY2157299 e inibidor de quinase 3 de 2,5 µM glicogénio sintase (GSK3i, CHIR99021). Quando a matriz é descongelada, completar com a mistura de fator de crescimento (fazendo a mistura de mestre) e armazenar no gelo. Nota: Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar como isto irá criar artefato dentro a patty matriz durante o chapeamento.</li>
	<li>Pré-aquecer um prato de cultura de tecidos de 24-poço em uma incubadora de 37 ° C antes de iniciar os procedimentos de isolamento de célula.</li>
</ol>2. cirúrgico modelo de isquemia e coleção de tecido
<ol><li>Uso de oito a dez semanas Yorkshire mestiços porcos de ambos os sexos (recomendado). Retire todos os alimentos 16-18 h antes da cirurgia. Os porcos permita o acesso à água em todos os momentos.</li>
	<li>Agendar os porcos a chegar pelo menos 48 horas antes dos experimentos para permitir a aclimatação ambiental. Nota: Técnicos treinados, veterinária e/ou laboratório, supervisionados por um veterinário licenciado fornecem assistência com procedimentos anestésicos e cuidados de rotina animal.</li>
	<li>Pré-medicar o porco com xilazina (1,5 mg/kg por via intramuscular (IM)) e cetamina (11-20 mg/kg (IM))15. Uma vez sedada, entube o porco orotracheally.</li>
	<li>Manter porcos sob anestesia geral com isoflurano (2-5%) vaporizado em 100% O2 até o momento da eutanásia.</li>
	<li>Coloque um cateter de (IV) por via intravenosa (veia de orelha recomendado) e administrar um fluido de substituição, tal como a solução de lactato de toques em uma taxa de manutenção de 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Execute rotina anestésica monitorização incluindo oximetria de pulso, eletrocardiografia e medições de pressão indirecta15. Monitorar a frequência respiratória e esforço do porco e ventilar manualmente ou mecanicamente conforme necessário se final das marés CO2 sobe acima de 55-60 mmHg. Nota: Anestesia adequada é confirmada pela monitorização contínua das tendências na frequência cardíaca (faixa 80-130 batimentos/min), pressão arterial não-invasiva (média pressão arterial 75-100 mmHg) e frequência respiratória (respirações por minuto 10-25)16e verificação periódica pela ausência de mandíbula e Tom anal. Profundidade da anestesia também pode ser julgada pelo grau de relaxamento muscular e fasciculação muscular após estímulo cirúrgico. Reflexos oculares são geralmente de nenhum valor16. Analgesia pode ser fornecida como dirigido pela política IACUC instituições. Neste caso, um opioide, como a buprenorfina, pode ser administrado durante a cirurgia.</li>
	<li>Coloque o porco em uma almofada de aquecimento e frear em prostração dorsal para o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Raspar o abdômen ventral e preparar usando esfoliante cirúrgico (solução de clorexidina) e álcool isopropílico.</li>
	<li>Fazer uma incisão de 8-10 cm da linha média ventral, usando uma lâmina de bisturi centralizada no umbigo para acessar o abdômen.</li>
	<li>Identifica o oral de aproximadamente 40 cm de intestino delgado (jejuno) até a junção ileocecal. Delinear a longos loops de 10 cm de jejuno por circunferencialmente, ligando o intestino duas vezes, um cm entre cada ligadura, antes da criação subsequente loops 10cm localizado por via oral (Figura 1).</li>
	<li>Crie dois loops por ponto de tempo de isquemia adjacentes um ao outro, um para isquemia e outro para isquemia com h 1 adicional de reperfusão se desejado. Para criar a isquemia completa (sem fluxo de artérias ou veias), braçadeira ou ligate vasculatura mesentérica usando pinças vasculares buldogue, curvados hemostatos de Halstead mosquito ou fio não absorvível 2-0 para 1, 2, 3 e 4h e em seguida, retire as braçadeiras para 1h de reperfusão, se desejado. Nota: Os autores criado todas loops de isquemia em ordem, começando com o loop isquêmica 4h e progrediram movendo-se proximalmente (para minimizar o tempo total de cirurgia). Para lidar com a possibilidade de que vizinhos isquêmicos segmentos intestinais podem danificar loops adjacentes, a ordem das argolas isquêmicas pode ser variada. Isso pode alterar o tempo cirúrgico total. Nota: O tempo de reperfusão pode ser variado baseado sobre a questão de pesquisa de interesse ou se terapias desejam ser testados durante o período de reperfusão. No entanto, como dano tecidual torna-se mais grave do aumento da duração da isquemia sozinha, lesão de reperfusão provável não contribui para mais lesão epitelial. Reperfusão provavelmente um papel suaves períodos de isquemia a seguir.</li>
	<li>Entre os pontos de tempo de isquemia, manter o abdômen cobertos ou fechados usando uma toalha estéril e/ou uma pinça de toalha. Nota: Dentro de um único animal para este experimento, oito segmentos isquêmicos podem ser criados. Identifica um segmento jejunal adicional, pelo menos 5-10 cm proximal ao último loop isquêmica, que servirá como um controle interno normal.</li>
	<li>Obstrua aproximadamente três vasos mesentéricos por pinça vascular buldogue ou pinça hemostática de mosquito curvada Halstead. Deve ter cuidado durante a aplicação da pinça hemostática porque os vasos são facilmente traumatizados. Tente empilhar os vasos dentro as mandíbulas dos grampos.</li>
	<li>No final do experimento, seguir eutanásia com pentobarbital 85-100 mg/kg IV, colete todos os laços de tecido, usando a tesoura de metzenbaum, após a morte foi confirmada sem batimento cardíaco auscultado e perda do reflexo corneal. Comece por recolher um pedaço de controle de jejuno normal pelo menos 5 - 10 cm proximal ao último loop isquêmica.</li>
	<li>Separar e armazenar os loops de cada ponto de tempo de lesões em pequenos recipientes de PBS gelado até que esteja pronto para isolamento de cripta. Nota: Se desejar, faça isquêmica loops de tempo suficiente para dividir em amostras separadas para histologia e cultura de células-tronco intestinal; no entanto, os autores descobriram que loops superiores a aproximadamente 10 cm de comprimento são mais prováveis tornar-se hemorrágica.</li>
</ol>3. a cripta (células-tronco) isolamento de isquemia e malhas de controle
<ol><li>Inverta a cada loop do intestino pequeno usando um fio de calibre 20 e fórceps do tecido para expor a superfície da mucosa. Amarre a parte superior e inferior do loop firmemente ao fio usando sutura (seda não absorvível 2-0 ou equivalente).</li>
	<li>Após inversão, enxágue cada loop em gelo frio PBS para remover detritos luminal.</li>
	<li>Colocar as amostras imediatamente nos tubos cónico de 50 mL contendo DR #1 no gelo por 30 min.</li>
	<li>Coletar loops começando com controle e siga com loops de aumentar incrementalmente durações de isquemia. Loops de menos tecido danificado (ou seja, controle e 1h isquêmica dos tecidos) podem ser abalados com força, encaixe o pulso para obter melhores resultados. Os tecidos de tecido severamente danificado (3 e 4 h de isquemia) devem ser suavemente bombou ou invertidos apenas como muita agitação causará cripta perturbação e destruição de tecido adicional. Os tubos devem ser abalados ou invertidos a cada 5 min enquanto no gelo.</li>
	<li>Transferi as amostras para DR #2 por 10 min em banho maria a 37° C. Agitar ou inverter os tubos a cada 5 min.</li>
	<li>Após a transferência dos tecidos, centrifuga os tubos cónicos contendo DR #1 a partir dos loops de 2-4 h danificado para remover o sobrenadante de EDTA (200 x g por 5 min). Estes tecidos são altamente danificados é possível que criptas já tem se tornar dissociadas. Remover o sobrenadante e ressuspender com um pequeno volume de PBS (5 mL) e avance para o passo 3.9.</li>
	<li>Retire amostras do DR #2 e colocar as amostras de tecido diretamente em 25 mL de PBS frio no gelo (rótulo como lavagem #1). Coloca as amostras em um agitador orbital no gelo em 60 rpm. Continuar a agitar ou inverter cada tubo por 30 s cada 2 a 5 min.</li>
	<li>Após a transferência dos tecidos, rotação dos tubos cónicos contendo DR #2 da 2-4 h danificado loops para remover o sobrenadante de EDTA (200 x g por 5 min). Estes tecidos são altamente danificados é possível que as criptas têm se tornar dissociadas. Remover o sobrenadante e ressuspender com um pequeno volume de PBS (5 mL) e avance para o passo 3.9.</li>
	<li>Retire uma alíquota de 50 μL de lavagem #1 (ou do DR) para verificar o grau de dissociação da cripta e a quantidade de detritos. Coloque o tecido em um novo tubo cónico de 50 mL (lavagem #2, #3, etc.) preenchido com 25 mL de frio PBS e agitar até criptas intactas são isoladas com detritos mínimo e vilosidades. Nota: O objetivo é ser capaz de isolar uma fração limpa com criptas intactas e detritos mínimo. Cada lavagem adicional limpará as células no entanto muita agitação começa a resultar em danos de tecidos/células secundárias. Além disso, os melhores resultados com menos contaminação serão alcançados se criptas são banhadas de uma etapa de lavagem e não de uma etapa de reagente de dissociação.</li>
	<li>Remover o tecido remanescente e centrifugar os tubos cónico de 50 mL a 200 x g durante 5 minutos para remover o sobrenadante e, em seguida, resuspenda restantes a pelota cripta em menor volume de PBS (5 mL).</li>
	<li>Usando um microscópio invertido, examine 50 alíquotas µ l de cada amostra para determinar o número de criptas/fração. O objetivo é 50-100 µ l de criptas/50, já que este será o tamanho da patty a matriz final. Nota: Se a amostra for muito concentrada, continue a adicionar PBS frio até a concentração desejada é alcançada. Se a amostra é muito diluída, determine o número de alíquotas necessárias para atingir o rendimento desejado cripta e ajustar.</li>
	<li>Alíquota volumes adequados de criptas (determinadas por observações alíquotas) em um tubo de microcentrifugadora. Por exemplo, se a amostra contém 50 µ l de criptas/50, em seguida, alíquota de 50 μL por patty Replica X 3 = 150 µ l / microcentrifuga tubo. Se a amostra contém apenas 25 µ l de criptas/50, em seguida, 2 alíquotas necessárias / patty X 3 Replica = 300 µ l/tubo.</li>
	<li>Criptas de pelota a 200 x g por 5 min a 4° C.</li>
	<li>Resuspenda suavemente criptas peletizadas com volume apropriado do mestre mix (50 μL por poço). Misture bem, pipetando rapidamente 15 vezes sem criar bolhas de ar. Nota: Pré-fixe a ponta da pipeta com PBS estéril frio antes de aspirar a mistura de mestre. Isto ajudará a manter a mistura de mestre de espalhar para fora. Dicas também podem ser mantidas na geladeira e colocadas no capô imediatamente antes da utilização.</li>
	<li>Dispense uma mistura mestre µ l 50 além de gotículas cripta em centro de cada poço da placa 24 bem pré-aquecido.</li>
	<li>Incubar a placa de cultura por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Sobreposição de cada patty de matriz com 500 µ l / bem de mídia da Iguatemi (sem fatores crescimento adicionais necessários no dia 0, como eles estão contidos o mestre mix).</li>
	<li>Adicione 500 µ l PBS estéril qualquer poços não utilizados que deixou no prato para manter a umidade.</li>
	<li>Contar o número de criptas chapeados no dia 0. Nota: É útil para pré-grade cada célula cultura placa em quadrantes para ajudar a garantir a contagem mais precisa.</li>
	<li>Contar o número de enterospheres cada 24 h e monitorar para desenvolvimento de enteroid diariamente.</li>
	<li>Adicione fatores de crescimento para cada bem cada 48 h. Remova a mídia do Iguatemi cada 96 h e substituir com mídia de fresco 500 µ l (fatores de crescimento devem então ser adicionados à mídia).</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

O desenvolvimento de um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar expande-se sobre modelos anteriores murino, permitindo o estudo de vários pontos de tempo de lesões no tecido dentro do mesmo animal. Há vários pontos de discussão crítica do presente protocolo, incluindo ligadura do vaso adequado, reperfusão de tecido e cultura de células da cripta bem sucedida.
Ligadura da embarcação adequada é essencial para a criação de um modelo de isquemia completa. Se a sutura é amarrada desigual ou a braçadeira não apertado completamente, o sangue de artéria paredes espessas pode continuar a entrar no tecido e não é possível sair devido ao colapso da veia de paredes finas. Isso resulta em extravasamento de sangue para a propria do lamina causando dano tecidual adicional. No entanto, dependendo do tipo de lesão isquêmica sendo estudado, isquemia completa ou hemorrágica pode ser desejada. Por exemplo, no processo de transplante intestinal, o intestino é completamente separado do suprimento vascular (artéria e veia) durante a fase de ressecção do processo, o que resulta em isquemia intestinal completa. Como alternativa, no entanto, quando o mesentério é torcido durante um evento como um Volvo intestinal, o retorno venoso é muitas vezes obstruído em primeiro lugar, levando a sangue adicional dentro do tecido antes de ser o suprimento arterial obstruído, criando assim hemorrágica, isquemia.
Lesão isquêmica resulta em danos aos tecidos, começando na ponta das vilosidades e estendendo-se até à base da cripta3. Durante a isquemia, energia sob a forma de trifosfato de adenosina continua a ser usado e gera a hipoxantina metabólito. Quando o tecido é perfundido com oxigênio, hipoxantina se torna metabolizada pela xantina oxidase e produz radicais livres superóxido, levando a lesão da mucosa e atração do tecido, danificando os neutrófilos17,18. Diferenças de espécie em arquitetura vascular da mucosa, bem como de expressão variado de xantina oxidase, resultar em diferentes graus de lesão de reperfusão3. Modelos de felinos e roedores de isquémia-reperfusão são mais suscetíveis à lesão de reperfusão de metabólitos de oxigênio reativo19,20. Em contraste, os porcos foram encontrados para ter menos xantina oxidase e, portanto, menor lesão de reperfusão, tornando este modelo mais comparável de isquemia intestinal humano21. Neste momento, o uso de nocaute ou modelos suínos transgênicos para estudar a lesão intestinal não foi descrito, tornando isso uma grande limitação deste modelo. Seleção do modelo adequado de animais varia de acordo com o processo da doença ou condição específica o pesquisador deseja estudar. Por exemplo, modelos suínos de isquemia até 6 h tem sido descrito22, Considerando que procedimentos mais isquêmicos murino modelos são de 45-60 min23.
Bem sucedida isolação das criptas intestinais do intestino normal e ischemically danificado permite que para o estudo de recuperação epitelial em cultura. Este sistema permite que o pesquisador focar exclusivamente o epitélio sozinho, como não há suprimento não vascular ou componente de células imunes a considerar. Isso oferece a oportunidade de estudar as interações de células epiteliais e recuperação após lesão além da resposta a diferentes fatores de crescimento, ou tratamentos administrados durante a cirurgia ou isolamento de cripta seguintes, completando os meios de cultura. Esta etapa permanece o mais difícil, como isolamento de loops severamente danificados requer agitação suave e rápida remoção das soluções contendo EDTA no caso de criptas tornam-se prematuramente dissociados. Se essas voltas do intestino não são lavadas, criptas têm o potencial de tornar-se contaminado na cultura. Como resultado, solução de antibiótico antimicótico foi adicionada para ambas as soluções DR além da mídia de Iguatemi. Outro ponto de discussão centra-se no intestino coletado como um controle normal. Como os animais se submeter a anestesia com possíveis alterações na perfusão do tecido sistêmico, juntamente com a possibilidade de circular mediadores inflamatórios secundários à isquemia, tecido de controle mesmo "normal" não pode representar um verdadeiro controle. Nesses experimentos, é digno de nota que o tecido de controle apareceu grosseiramente e histologicamente comparável ao tecido de animais que não sofreu isquemia em outras experiências (Gonzalez, L.M., dados não publicados, 2017).
Em resumo, este método descreve um modelo reproduzível de isquemia intestinal porcina, que modela de perto o que ocorre na isquemia humana. Além disso, o isolamento de células-tronco intestinais de loops isquêmicas é descrito, que serve para estudar a reparação epitelial e possível resposta ao tratamento na cultura.

Isquemia intestinal, o resultado da disponibilidade de oxigênio diminuída devido a uma redução ou completa oclusão do fluxo sanguíneo para o intestino, continua a ser uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes humanos e animais,1,2. Danos isquêmicos, juntamente com a inflamação subsequente e infiltração celular, leva ao compromisso de barreira da mucosa. A barreira da mucosa é fundamental para a prevenção da translocação bacteriana e toxinas associadas para a circulação sistêmica3,4. A reperfusão subsequente dos tecidos isquêmicos pode resultar na formação de espécies reativas de oxigênio que podem agravar a lesão5de danificar. Desde que a isquemia intestinal é raramente evitável, mais atual pesquisa centrou-se na avançando técnicas para detecção precoce de isquemia e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que reduzem a reparação da mucosa lesão ou alvo de reperfusão.
Modelos animais têm sido amplamente utilizados para expandir o nosso conhecimento de ciência básica de lesões de isquémia-reperfusão e permanecem imperativo para investigação de translação. Modelos de roedores têm sido o mais utilizado devido à sua capacidade de ser geneticamente manipulada6. Mais recentemente, no entanto, o uso de modelos animais grandes, especificamente o porco, sido advogou para futuros estudos translacionais, devido a uma série de vantagens, incluindo as semelhanças anatômicas e fisiológicas de porcos para humanos7,8. Uma variedade de modelos de lesão foram desenvolvidos para estudar lesões de isquémia-reperfusão e incluem completa oclusão vascular, isquemia do low-flow e segmentar oclusão vascular mesentérica. Uma revisão completa destes modelos é fora do âmbito deste artigo, no entanto os autores direcionar os leitores para uma recente revisão3.
Além de modelos em vivo , o uso de sistemas de cultura celular ex vivo oferece uma ferramenta promissora para estudar a homeostasia intestinal e reparação após lesão. Células-tronco intestinais são responsáveis pela proliferação celular e o volume de negócios do revestimento epitelial intestinal. Quando isolada do intestino normal ou ferido, células-tronco intestinais podem ser mantidas em cultura e servir como uma ferramenta ou modelo para o estudo de células-tronco e biologia da célula epitelial. Métodos para isolar e estabelecer estas tridimensional cultura sistemas (denominados enteroids e colonoids quando derivado do intestino de pequeno e grande, respectivamente) foram descritos para uma variedade de espécies e órgão sistemas9,10 ,11,12,13. Especificamente, dentro do trato gastrointestinal, estes sistemas de cultura tem sido usado para doença gastrintestinal modelo, incluindo câncer, infecção do patógeno e de doença inflamatória intestinal14. Neste momento, não existem relatos descrevendo o isolamento e manutenção de células-tronco intestinais do intestino delgado ischemically ferido em qualquer espécie. Portanto, aqui descrevemos o processo de isquemia intestinal em um modelo de suínos animal novela, grande que resulta em lesão reprodutível e a capacidade de isolar células-tronco intestinais do intestino normal e ischemically ferido para o estudo adicional de recuperação ex vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP-399</td>
			<td style="width:167px;">Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Distilled, deionized water (ddH2O)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to prepare EDTA and PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">20688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">ED45</td>
			<td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Y-27632</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Glutamax</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-096</td>
			<td>Anti-Anti solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Wnt-3a</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">5036 WN/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Rspondin1</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">4645- RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">LY2157299</td>
			<td style="width:107px;">SelleckChem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">52230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Human [leu]15-Gastrin 1</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">SB202190</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">A83-01</td>
			<td style="width:107px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Water, WFI Quality</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Matrigel Matrix, GFR</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">356231</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">24 Well Culture Dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Conical Tube, 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">504169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Debakey Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501752</td>
			<td>Curved or straight</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Metzenbaum Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mosquito Forceps, Curved</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td>503724-12</td>
			<td>Curved or straight (503728-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting Co.</td>
			<td>52120-40P</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Silk, 2-0&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">685S-BUT</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Towel Clamps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">V503382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Wire suture, 20 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">19075</td>
			<td>Cut and straighten before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Surgical Towels</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">ST1833</td>
			<td>Any similar product is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Lactated Ringers Solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">VINV-CHMX-SCRB</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isopropyl Alcohol 70%</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">MS071HS</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">IV catheter, 22 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">2225PUR</td>
			<td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Xylazine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Ketamine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">11695-6835-1</td>
			<td>Controlled medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isoflurane solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10015516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td>
			<td style="width:107px;">Vortech Pharm.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tpump Core Warming System; others are available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Mindray Datascope Monitor</td>
			<td style="width:107px;">Mindray North America</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Vetland Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Fluid Pump</td>
			<td style="width:107px;">Abbott Hospira</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

Isquemia intestinal permanece das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes humanos e veterinários. Muitos processos de doença resultam em isquemia intestinal, quando o fornecimento de sangue e, portanto, o oxigênio é diminuída para o intestino. Isso leva a perda da barreira intestinal e danos no tecido subjacente. Células-tronco intestinais residem na base das criptas de Lieberkühn e são responsáveis pela renovação intestinal durante a homeostase e seguir lesão. Ex vivo técnicas de cultura celular permitiram o estudo bem sucedido de interações de células-tronco epiteliais, estabelecendo as condições de cultura que suportam o crescimento dos sistemas de órgãos, como epiteliais tridimensionais (denominado "enteroids" e" colonoids"no intestino pequeno e grande, respectivamente). Estes enteroids são compostas de cripta e vilosidades, como domínios e maduro para conter todos os tipos de célula encontrados dentro do epitélio. Historicamente, murino modelos têm sido utilizados para estudar a lesão intestinal. No entanto, um modelo porcino oferece várias vantagens, incluindo a similaridade de tamanho bem como gastrointestinal anatomia e fisiologia dos humanos. Utilizando um modelo de suínos, estabelecemos um protocolo em que o segmentares loops de isquemia intestinal pode ser criado dentro de um único animal, permitindo o estudo de diferentes pontos de isquemia e reparar em vivo. Além disso, descrevemos um método para isolar e cultura de células-tronco intestinais dos loops isquêmicas do intestino, permitindo o estudo continuado de reparação epitelial, modulada por células-tronco, ex vivo.

Isquemia intestinal completa foi criada em pequenas loops intestinais utilizando oclusão vascular com suturas ou grampos, como mostrado na Figura 1. Soltando os grampos, um período controlado de reperfusão pode ser realizado, permitindo estudo adicional de lesão de reperfusão subsequente se desejado. Todos os animais sobreviveram durante o procedimento com mínima complicação até eutanásia. A complicação cirúrgica mais comum foi a hipotensão, que possa ser resolvido com a suplementação de um inotrope positivo como a dobutamina.
Se executada corretamente, lesão isquêmica começará a ponta das vilosidades intestinais e migrar para baixo dentro da cripta, como a duração dos aumentos de isquemia (Figura 2). Um erro comum com a técnica cirúrgica pode ocorrer quando os vasos sanguíneos não são ligados ou fixados uniformemente. O resultado é uma isquemia hemorrágica (Figura 3), em que a veia de paredes finas recolhe antes da artéria, permitindo a sangue adicional para se infiltrar nos tecidos. Isto é visto grosseiramente como uma escura púrpura serosas superfície (Figura 3, à esquerda) em comparação com uma superfície mais pálida durante a isquemia completa (Figura 3, direita).
Após a remoção das argolas intestinais isquêmicas, criptas intestinais foram com sucesso isoladas seguindo o protocolo de dissociação (Figura 4). Como esperado, criptas de momentos mais severamente danificados, muitas vezes foram quebradas (f; fragmento) e frações de cripta continham mais restos celulares do plano de fundo quando comparado com aqueles que passaram por n ou dano brando. Durante o protocolo, intestino gravemente ferido deve ser agitado suavemente para evitar danos adicionais ao tecido subjacente. Demasiado aproximadamente tremer pode resultar em novos danos de cripta e a maioria das criptas terminando no DR de soluções contendo EDTA, resultando em perturbações adicionais.
Uma vez chapeado, criptas de todos os pontos de tempo de isquemia sobrevivem e são capazes de se estabelecer na cultura (Figura 5). Quando normais e levemente danificadas criptas intestinais são banhadas em cultura, formulário de enterospheres dentro de 24-48 h. Com severos danos isquêmicos (h de 3 e 4), as criptas intestinais sobrevivem mas são danificadas, resultando na formação de esferas muito menores inicialmente. Por 72-120 h, enteroids se tornam mais complexas com lúmens centrais óbvios e estruturas de brotamento. Em geral, há uma eficiência de crescimento diminuiu de criptas, bem como um diminuição da tamanho de enteroids, derivado do tecido intestinal severamente danificado (Gonzalez, L.M., dados não publicados, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figura 1 : Modelo cirúrgico da isquemia intestinal completa em um modelo porcino. A) normal jejuno porcino exteriorizado. B) mesentéricos vasos tem sido ligados com sutura criando isquemia intestinal. C) isquemia criada usando pinças vasculares buldogue para permitir a reperfusão do tecido se desejado. D) intestinal vasculatura imediatamente após a remoção dos grampos vasculares. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figura 2 : Evidência histológica (hematoxilina e eosina (H & E) mancha) de aumentar dano epitelial após períodos mais longos de isquemia intestinal completa. Dano começa na ponta das vilosidades com perda gradual da camada epitelial simples célula, embotamento das vilosidades e dano celular, estendendo-se até a cripta de base com ferimentos graves (até 4 h de duração). barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figura 3 : Evidência bruta e histológica de isquemia hemorrágica. A) bruta fotografia comparando isquemia hemorrágica (laço à esquerda) e isquemia completa (loop de direito). Quando a vasculatura não é ligada ou fixada uniformemente, sangue pode continuar a se infiltrar nos tecidos, resultando em danos e inflamação adicional. B) H & E imagens de isquemia hemorrágica de aumentar a duração de 1-4 h. Além do dano celular visto com isquemia completa, há indícios de infiltração de células vermelhas do sangue dentro da propria do lamina circundante. barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figura 4 : Alíquotas de criptas intestinais isoladas de loops do intestino isquêmico e normal. Completas, intactas criptas intestinais (asteriscos) foram isoladas com êxito de cada loop do intestino. Como esperado, criptas de mais pontos de tempo severamente danificados, muitas vezes foram quebradas (f; fragmento) e frações de cripta continham mais restos celulares do plano de fundo quando comparado com aqueles que passaram por n ou dano brando. barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figura 5 : Curso de tempo do crescimento de células-tronco intestinal após o isolamento de loops isquêmicas do intestino delgado. Quando normais criptas intestinais foram banhadas em cultura, enterospheres formado dentro de 24-48 h. Com graves danos isquêmicos (h de 3 e 4), criptas sobrevivem mas formam esferas muito menores inicialmente. Por 72-120 h, enteroids se tornam mais complexas com lúmens centrais óbvios e estruturas de brotamento. 20 µm escala bar a menos que indicado. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fator de crescimento</td>
			<td>Diluente de</td>
			<td>Concentração das ações</td>
			<td>Diluição</td>
			<td>Diluição de trabalho</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>1 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cabeça</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>FEG</td>
			<td>10mM de ácido acético</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µ g/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamida</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrina</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>2,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µ g/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: tabela de fator de crescimento reagente. Resumo das soluções estoque de fator de crescimento e soluções de trabalho utilizados no presente protocolo.

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Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Este protocolo permitirá aos leitores para estabelecer com sucesso um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar e posteriormente isolar e cultura de células-tronco para o estudo da reparação epitelial após lesão intestinais.

Isolamento de células-tronco intestinal e cultura em um modelo suíno de isquemia Intestinal pequena segmentar

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K visualizações.  North Carolina State University. Este protocolo permitirá aos leitores para estabelecer com sucesso um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar e posteriormente isolar e cultura de células-tronco para o estudo da reparação epitelial após lesão intestinais.

Vídeo: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Medicina

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

Avaliação Funcional da motilidade intestinal e inflamação da parede do intestino em Roedores: Análises em um modelo padronizado de Manipulação Intestinal

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality of life when compared to dialysis. Although the last few decades have seen major improvements in patient outcomes following kidney transplantation, the increasing shortage of available organs represents a severe problem worldwide. To expand the donor pool, marginal kidney grafts recovered from extended criteria donors (ECD) or donated after circulatory death (DCD) are now accepted for transplantation. To further improve the postoperative outcome of these marginal grafts, research must focus on new therapeutic approaches such as alternative preservation techniques, immunomodulation, gene transfer, and stem cell administration.
Experimental studies in animal models are the final step before newly developed techniques can be translated into clinical practice. Porcine kidney transplantation is an excellent model of human transplantation and allows investigation of novel approaches. The major advantage of the porcine model is its anatomical and physiological similarity to the human body, which facilitates the rapid translation of new findings to clinical trials. This article offers a surgical step-by-step protocol for an autotransplantation model and highlights key factors to ensure experimental success. Adequate pre- and postoperative housing, attentive anesthesia, and consistent surgical techniques result in favorable postoperative outcomes. Resection of the contralateral native kidney provides the opportunity to assess post-transplant graft function. The placement of venous and urinary catheters and the use of metabolic cages allow further detailed evaluation. For long-term follow-up studies and investigation of alternative graft preservation techniques, autotransplantation models are superior to allotransplantation models, as they avoid the confounding bias posed by rejection and immunosuppressive medication.

Porcine models of organ transplantation provide an important platform to study mechanisms of organ preservation. This article describes a heterotopic porcine renal autotransplantation model, which allows investigating new approaches to improve the outcome of transplantation using marginal kidney grafts.

Heterotópico Renal autotransplante em um modelo suíno: Um Protocolo Passo-a-Passo

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

Um modelo pré-clínico do rato para o estudo da lesão da Isquemia-reperfusion na microcirurgia reconstrutiva

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

Avaliação em tempo real da microperfusão da medula espinhal em um modelo suíno de isquemia/reperfusão

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

Efeito do ácido hialurônico 35 kDa em um modelo in vitro de lesão e cicatrização do intestino delgado prematuro usando monocamadas derivadas de enteróides

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...