Name: novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
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Agradecemos o Professor Chen Bin, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang para ajuda com a configuração do sistema de eletroporação. Este trabalho foi financiado por doações do grupo de benefício de câncer de Santa Cruz e NIH para Z.A.W.

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as diretrizes e normas da institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia em Santa Cruz.
1. plasmídeo e preparação de ferramentas
<ol><li>Para cada bexiga transfect, preparar pelo menos 20 µ l de DNA do plasmídeo (1 µ g / µ l).</li>
	<li>Adicione 1 µ l de Trypan azul para a 20 µ l de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Pipeta para misturar bem.</li>
	<li>Autoclave cirúrgica todos os instrumentos e esterilizar a área de trabalho com 70% de etanol. Spray instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol a 70% com frequência ou usar um esterilizador de grânulo de vidro ao executar as seguintes etapas para manter condições estéreis.</li>
</ol>2. médico-Légal Animal
<ol><li>Use um sistema de anestesia superior de tabela para anestesiar o animal com isoflurano. Ligue o tanque2 O e ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para 1 L/min.</li>
	<li>Coloca um rato adulto de C57BL/6J feminino na câmara de indução. Ativar e ajustar o vaporizador de isoflurano para 3% para a indução. O mouse deve estar em anestesia dentro de 2 min. administrar analgésico de buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea após a remoção do mouse da câmara de indução para analgesia preemptiva. Nota: No presente protocolo, ratos fêmeas são usados, porque são mais fáceis de trabalhar com durante cateterismo de uretra. O protocolo também funciona para ratos masculinos, mas um cuidado adicional é necessária ao executar a etapa 3.</li>
	<li>Aplica a pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar ressecamento. Coloque o mouse anestesiado virado para cima sobre uma almofada de aquecimento com seu nariz do cone de nariz. Gire o interruptor de circuito de ar para soltar isoflurano através do cone de nariz.</li>
	<li>Conter a cabeça e o cone de nariz com fita adesiva. Ajuste o vaporizador de isoflurano para 2% para manutenção.</li>
	<li>Conter os membros com fita adesiva. Realize testes de dedo-pinch para certificar-se de que o animal está em anestesia profunda e em seguida, raspar a região abdominal.</li>
</ol>3. urina depleção e lavagem da bexiga
<ol><li>Aplique lubrificante ao cateter (24G, comprimento de 2,11 cm, diâmetro externo de 0,045 cm) e certifique-se de que sua superfície externa é totalmente coberto.</li>
	<li>Insira o cateter na abertura da uretra e lentamente empurre-os até atingir a bexiga, momento em que a urina deve fluir através do cateter. Pressione suavemente o abdômen para ajudar a depleção de urina.<ol>
<li>Verifique se o cateter é inserido corretamente a bexiga, observando a urina automática out-fluxo. Evitar a perfuração da parede da uretra e da bexiga e aplique o lubrificante várias vezes se necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descarte a urina com uma pipeta para um copo de resíduos.</li>
	<li>Pipete 80 µ l de soro de tampão fosfato (PBS) para a extremidade externa do cateter, com a outra extremidade ainda na bexiga. Cuidadosamente, anexe uma seringa de 1 mL para o cateter. Empurre suavemente a seringa para injetar a PBS para a bexiga. Embora alguns PBS o cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.</li>
	<li>Remova a seringa. Espere para PBS drenar para fora da bexiga. Pressione suavemente o abdômen para evacuar PBS.</li>
	<li>Descarte a PBS o cateter com uma pipeta para o copo de resíduos.</li>
	<li>Repita PBS lavagem (etapas 3.4-3.6) para mais duas vezes. Nota: É essencial trabalhar suavemente durante estas etapas de lavagem. Sangue no cateter ou falhas de automatic out-fluxo de líquido geralmente indica a uretra é perfurada através de. Também é importante evitar a introdução de bolhas de ar, como eles irão diminuir a eficiência de eletroporação.</li>
</ol>4. plasmídeo entrega
<ol><li>Aplicar o etanol a 70% no abdômen do mouse e usar um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1 cm para abrir a pele abdominal acima da bexiga.</li>
	<li>Pipetar pelo menos 20 µ l de solução de azul de Trypan além de plasmídeo a extremidade externa do cateter e aplique a seringa.</li>
	<li>Injete a solução de plasmídeo da bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem sucedida. Deixe algum líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.</li>
	<li>Pegue o orifício uretral externo usando uma pinça e em seguida, retire o cateter e a seringa. Use uma sequência de caracteres para apertar o orifício uretral externo. Faça dois loops com a sequência de caracteres e em seguida amarre com dois nós. Nota: Aperto do uretral é importante para prevenir o refluxo de líquido do plasmídeo.</li>
	<li>Liga o gerador de eletroporação com os seguintes parâmetros: 33V, 50 ms de tempo de trabalho e tempo de intervalo de ms 950.</li>
	<li>Segurar a bexiga com uma pinça e comprima a bexiga com dois eletrodos. Pressione o pedal para executar a eletroporação. Nota: Os impulsos elétricos são definidos para ocorrer 5 vezes com intervalos curtos após cada impulso pedal. O mouse pode contorcer-se neste processo. Empurrar o pedal mais uma vez que pode aumentar a eficiência de entrega, mas também muitos pulsos elétricos podem danificar a integridade do tecido do Urotélio.<ol>
<li>Evite qualquer contacto entre a pinça e os eletrodos, como isso irá gerar uma faísca.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. recuperação
<ol><li>Suture a abertura abdominal e pele com esterilizados para suturas cirúrgicas e clipes. Aplica iodo sobre o ferimento.</li>
	<li>Retire o animal do sistema de isoflurano. Administre analgésico buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica.</li>
	<li>Manter o animal sobre a almofada de aquecimento e devolvê-lo para a gaiola em casa depois da recuperação completa. Verifique se o animal pelo menos uma vez por dia para mobilidade normal, beber e alimentar comportamentos e sem sinais de infecção até que a incisão é curado e remova os grampos. Administre injeções subsequentes de buprenorfina analgésico se o animal exibe sintoma de dor, tais como reduzida aliciamento, aumento da agressividade e vocalização.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice.">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li><li>Negrete, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. 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C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

Os autores não declaram nenhum interesse de concorrente.

Electroporation aumenta a permeabilidade da membrana celular e é uma tecnologia poderosa para gene electrotransfer16. Entrega do gene em roedores vivos por eletroporação tem sido frequentemente usada em neurobiologia campos17,18,19,20,21. Suas aplicações potenciais em muitos outros órgãos não tem sido exploradas extensivamente. ...

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo específico de tecido ou célula de interesse envolve a criação de alelos geneticamente modificados com Cre e flox sites para várias gerações. Todo o processo pode ser caro e demorado, especialmente se o objetivo é atingir múltiplos genes tecido-especificamente. Recentemente, tecnologias de edição de gene como clusterizadas regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) foram aplicadas aos vários órgãos dos ratos para induzir alterações genéticas de tecido-específica para o cancro autóctone modelagem3, 4,5,6,7 ou doença correta mutações em situ8,9. Nesses estudos, a entrega dos vetores gRNA geralmente foi conseguida através de adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção do órgão ou injeção de cauda-veia hidrodinâmica. A relativa facilidade de entrega dos componentes CRISPR para o pulmão e o fígado tem melhorado muito a conveniência e eficiência de câncer nesses órgãos em comparação com os modelos tradicionais de rato Cre-Lox com base de modelagem.
O bexiga Urotélio é onde a maioria dos tumores de bexiga são originários. A entrega dos vetores de DNA para a bexiga Urotélio para terapia de modelagem ou o gene do câncer é dificultada por uma camada de glicosaminoglicano na superfície apical urotelial, que age como uma barreira para a aderência do vírus infeccioso10,11. Vários agentes de pré-tratamento como Syn3 e o dodecil-β-d-maltoside tem sido utilizados para romper essa barreira e melhorar adenovírus infecção eficiência12,13,14. Se o vírus adeno-associado (AAVs) efetivamente podem infectar a bexiga não foi relatado. Em geral, um método de entrega com base não-virais seria desejável. Aqui, descrevemos um método inovador desenvolvido no laboratório para entrega eficiente do plasmídeo de DNA para o Urotélio rato através de cateterismo de uretra e eletroporação. Porque a nossa abordagem não implica pré-tratamento químico da camada glicosaminoglicano ou produção de vírus, significativamente simplifica a entrega de plasmídeos de DNA no rato Urotélio de bexiga e deve facilitar estudos em vivo doenças da bexiga.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB Syringe</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K&amp;amp;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Cover the heat mat with paper towels</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &amp;micro;L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmid CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platinum tweezertrode 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm diameter</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>String cord</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td></tr><tr><td>Tape, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td><td>PBS animal health</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Table top system anesthesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violet suture 18&quot; FS-2 cutting 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip applier</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) são extremamente valiosos em revelando romance biológicas insights sobre os mecanismos de iniciação e progressão de doenças como o câncer. Os ratos transgénicos e condicional nocaute foram usados frequentemente para superexpressão do gene ou ablação em tecidos específicos ou célula tipos em vivo. No entanto, gerar modelos de rato germline pode ser demorada e dispendiosa. Recentes avanços no gene edição de tecnologias e a viabilidade de entrega de plasmídeos de DNA por infecção viral permitiram a rápida geração de modelos de câncer não-germline autóctones do mouse para vários órgãos. A bexiga é um órgão que tem sido difícil para vetores virais acessar, devido à presença de uma camada de glicosaminoglicano cobrindo o Urotélio. Aqui, descrevemos um método novo desenvolvido em laboratório para entrega eficiente de plasmídeos de DNA no rato bexiga Urotélio em vivo. Através de instilação intravesical de plasmídeo de DNA pCAG-GFP e eletroporação de bexiga cirurgicamente exposta, nós mostramos que o plasmídeo de DNA pode ser entregues especificamente nas células uroteliais da bexiga para expressão transiente. Nosso método fornece uma maneira rápida e conveniente para superexpressão e nocaute de genes na bexiga do mouse e pode ser aplicado para a construção de GEMMs de câncer de bexiga e outras doenças urológicas.

Para demonstrar o sucesso da entrega do gene para a bexiga Urotélio, usamos o plasmídeo de15 pCAG-GFP para eletroporação. 20 µ l de solução de azul de Trypan e plasmídeo foi injetado através da uretra e 5 pulsos elétricos foram administrados. Após 48 h, nós dissecado a bexiga de rato e observadas manchas de fluorescência de GFP sob um microscópio de fluorescência de dissecação, Considerando que um negativo controlar a bexiga que não sofreu electro...

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Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.4K visualizações.  University of California, Santa Cruz. Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.

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Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neurociência

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Medicina

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Biologia

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense and transmit information about its environment to the underlying tissues, promoting voiding function and behavior. Disruption of the urothelial barrier, or its sensory/transducer function, can lead to disease. Studying these complex events is hampered by lack of simple strategies to alter gene and protein expression in the urothelium. Methods are described here that allow investigators to generate large amounts of high-titer adenovirus, which can then be used to transduce rodent urothelium with high efficiency, and in a relatively straightforward manner. Both cDNAs and small interfering RNAs can be expressed using adenoviral transduction, and the impact of transgene expression on urothelial function can be assessed 12 h to several days later. These methods have broad applicability to studies of normal and abnormal urothelial biology using mouse or rat animal models.

Methods are described for the generation of large amounts of recombinant adenoviruses, which can then be used to transduce the native rodent urothelium allowing for expression of transgenes or downregulation of endogenous gene products.

Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Electroporation-Mediated In Vitro Gene Delivery: An Electric Pulse Technique to Introduce Fluorescent Reporter Protein-Encoding Plasmids Into Cultured Cells

Source: Lo, J. C. W. et al., <a href="https://www.jove.com/v/63283">Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2021)
This video demonstrates the electroporation technique that introduces fluorescent protein-encoding plasmid DNA into mouse primary cerebellar granule cell precursors.

Entrega de genes in vitro mediada por eletroporação: uma técnica de pulso elétrico para introduzir plasmídeos codificadores de proteínas repórter fluorescentes em células cultivadas

Source: Lo, J. C. W. et al., Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

Técnicas de transferência gênica

Transfecção

Urine Depletion and Bladder Rinsing in Mouse Model: A Catheter-based Procedure to Empty and Wash Murine Urinary Bladder

Source: Yu, C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe a catheter-based procedure to empty and rinse the urinary bladder of a mouse model. The prepped mouse can then be used for further experimental procedures.

Depleção de urina e enxágue da bexiga em modelo de camundongo: um procedimento baseado em cateter para esvaziar e lavar a bexiga urinária murina

Source: Yu, C. et al. Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe ...

Pesquisa do câncer

Câncer do trato urinário

Estudos com modelo animal

Delivery of DNA Plasmids into Urothelium of Mouse Bladder: An Electroporation-based Procedure to Efficiently Deliver DNA Plasmids into Urothelial Cells of Murine Bladder to Generate Genetically Engineered Models

Source: Chuan, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation.</a> J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video demonstrates the delivery of DNA plasmid into the urothelium of the mouse bladder using a combination of urethral catheterization and electroporation techniques. The described procedure allows the generation of mouse bladder cancer models.

Entrega de plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongo: um procedimento baseado em eletroporação para entregar plasmídeos de DNA de forma eficiente em células uroteliais da bexiga murina para gerar modelos geneticamente modificados

Source: Chuan, Y. et al. Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation. J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

Source: Woodard, L. E. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56324" target="_blank">Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

Injeção hidrodinâmica da pelve renal: uma técnica para entregar DNA diretamente em células renais de modelo murino

Source: Woodard, L. E. et al. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, ...