Os autores gostariam de agradecer o apoio do Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Award Forum, bem como os fundos do Instituto de Medicina Regenerativa de Cedars-Sinai, ea família de Guerin. O projeto descrito foi apoiado na forma de um voucher CTSI Núcleo financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, Grant UL1RR033176, e agora está no Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Grant UL1TR000124. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIH.

Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Cedars-Sinai IACUC. Os investigadores devem garantir o cumprimento IACUC institucional antes de prosseguir. Todas as ferramentas e os reagentes devem ser esterilizados antes de utilizar. 1. Preparação de Ferramentas, Soluções e Mistura DNA <ol><li> Insira 100 mm fogo borosilicato polido tubos capilares de vidro em um extrator micropipeta. Definir aquecimento para permitir a tração ponderada padrão para formar ponteira de aproximadamente 17,5 mm. Cortar pontas afiadas com tesouras cirúrgicas, a uma distância de aproximadamente 8-9 mm a partir do início da ponta para criar uma abertura de cerca de 100 um de diâmetro. </li><li> Faça um estoque de 1% w / v solução verde rápido pela mistura de água livre de nuclease filtradas (utilizando um filtro de seringa de 20 mm) com verde rápido seca. </li><li> Isolar o plasmídeo purificado de ADN livre de endotoxina que é altamente concentrada (ou seja,&gt; 3 mg / mL), diluída em Tris-EDTA (TE) de tampão. Adicionar quantidades desejadas de plasmídeoa mistura diluída em tampão TE e adicionar uma proporção de 1:10 da solução verde rápido 1% (fazendo um 0,1% w / v de concentração final de verde rápido). Use uma concentração final de 0,5-2,0 mg / mL de plasmídeo para a expressão robusta de transgenes. </li></ol> 2. Animais Anestesia, Pipeta Carregando e Pial Superfície plasmídeo Injeção <ol><li> Induzir a anestesia hipotermia em 1-2 dia ratos pós-natal, colocando-os em uma placa de Petri, que é colocado no gelo por 5-8 min (tempo dependente da idade filhote / peso). Uma vez que a hipotermia é confirmado pela falta de circulação de e / ou beliscar toe cauda reflexo, os ratos estão prontos para ser injetado. Coloque os animais de volta no gelo se reflexos da dor são evidentes. O procedimento de injeção e eletroporação levar menos de 2-3 minutos no total para que o tempo de hipotermia, injeção, e os procedimentos de eletroporação de acordo para manter a anestesia adequada. </li><li> Durante a anestesia, utilizando uma pipeta de padrão, cuidadosamente pipeta quantidade de plasmi desejard misturar a ser injetada (0,5-2 mL) sobre um pedaço de filme de cera de parafina para referência. Aqui, um volume total de 0,5 mL de mistura de plasmídeo é injectado. Em seguida, usando um injetor de micro, insira cuidadosamente montado pipeta capilar de vidro em tubo contendo mistura plasmídeo. Tenha cuidado extra para evitar a ponta de quebrar por ter certeza que ele não toque nas bordas do tubo. Aspirar a solução para a pipeta, discando-se lentamente para trás o botão de transferência. Uma vez que um volume suficiente foi carregado para a pipeta, disque para a frente até que a pressão retorna à posição neutra de 0 hPa. </li><li> Usando 300-450 hPa de pressão para injeção para assegurar a pressão adequada para um enchimento da superfície / espaço meníngea pial, coloque a ponta nas proximidades da injeção parafina referência filme pipetado (de 2,2) e usar o pedal do micro injetora para ejetar um de volume no filme cera de parafina. Ajuste a pressão de acordo até a quantidade ejetado é igual ao referenc previamente pipetadavolume de e. </li><li> Uma vez que a ponta tenha sido equilibrada e anestesia foi confirmado, os filhotes são pronta para ser injectada. </li><li> O objectivo da experiência é para injectar a mistura de plasmídeo sob o crânio e acima da superfície pial para permitir a electroporação do ADN para baixo, para os progenitores superfície pial (Figura 1A). Para injeções córtex, segurar o filhote para baixo, usando o polegar eo dedo indicador da mão menos dominante. Os hemisférios corticais e outras estruturas superficiais, tais como os colículos superiores são visíveis entre P0 e P2, permitindo a fácil orientação destas estruturas (Figura 1B). Usando mão e alvo a região dominante desejado do córtex (ou seja, motor, somatossensorial, etc), inserir pipeta passado a pele e crânio com cuidado para evitar artérias cerebrais. Certifique-se para impedir a continuação da penetração da ponta passado o crânio (o que é indicado pela ausência de uma maior resistência apenas após a perfuração do crânio). </li><li> Injetar plasmaID da solução usando o pedal do micro injetora e certifique-se dispersa uniformemente em todo o tecido (Figura 2A). Nota: É muito importante determinar empiricamente uma abordagem que maximiza a entrega plasmídeo evitando hematoma devido à pressão do fluido. Isto pode ser feito através do ajuste da duração da injecção, o ângulo, o volume, e o local alvo preciso para evitar ruptura vascular. </li><li> Não deixe de experimentar e manter a ponta de secagem entre as injeções, colocando a ponta em gotículas de teste a partir de injeções feitas anteriormente no papel de cera ou parafina filme plástico. Isto é necessário para evitar a acumulação de solução de ADN ponta evaporado e cristalizado, o que pode resultar no entupimento da ponta e volumes de entrega inconsistentes. </li></ol> 3. Eletroporação <ol><li> Defina o Electroporator para 135-150 V para cinco pulsos, com duração de 50 milissegundos, com intervalos de 950 ms entre cada pulso. A fim de aumentar a condutância eevitar a queima da pele, cobre de 3 mm tweezertrodes platina com gel de electroporação. Verifique se há reflexos beliscar dedo do pé e cauda neste momento para garantir a anestesia. Se ágil, colocar no gelo por alguns minutos para anestesiar. </li><li> Para córtex (e colículo superior) injecções, empregar um eléctrodo de 3 mm (Figura 2B) para aumentar a viabilidade das crias (em comparação com a 7 - e 10-mm eléctrodos, os quais são utilizados para a zona ventricular electroporação). Coloque a sonda carregada negativamente do eléctrodo sobre a área injectado e a sonda carregada positivamente em torno da região abaixo do olho contralateral de modo que a orientação do eléctrodo é um ângulo de 45-60 ° em relação à linha média (Figura 2C). </li><li> Utilize o pedal da electroporador para acionar corrente e mantenha tweezertrodes no local por 3-5 pulsos, dependendo da idade das crias e de peso, de forma eficaz visando DNA em células da superfície pial subjacentes quando representando curvaturados hemisférios. Nota: O pólo negativo pode ser varrida sobre a área de injecção no meio de legumes ou um eléctrodo maior pode ser utilizada para aumentar a área de electroporação. </li><li> Imediatamente após a eletroporação, cuidadosamente limpar gel de filhotes e colocá-los sob uma lâmpada de calor por cerca de 5 min. </li><li> Filhotes vai agudamente perder sua tonalidade rosa-avermelhado natural nos minutos após eletroporação devido à cianose. Observe os filhotes para a recuperação da cor natural eo início do movimento normal antes de devolvê-los para suas gaiolas. </li><li> Certifique-se de re-socialização com a mãe, observando se ela traz os filhotes de volta ao ninho e começa a preparação deles. Se ela se torna agressivo, certifique-se filhotes de cachorro não tem restos de gel e incubar-los com algumas das roupas de cama para transferir o cheiro para os filhotes. </li></ol> 4. Modificações para Segmentação do colículos superiores Segmentação: <ol><li> Inject o colículo superior, da mesma maneira como o córtex, mas notar que a região alvo encontra-se imediatamente posterior e lateral de lambda e aproximadamente na linha média (Figuras 3A e 3B). Com injecções de sucesso, a mistura de plasmídeo naturalmente enche os contornos do colículo superior. Uma vez que as injecções foram feitas com sucesso, os animais estão prontos para electroporação. </li></ol> Eletroporação: <ol><li> De uma forma muito semelhante, para injecções colículo superior, colocar a sonda carregada negativamente do eléctrodo sobre a área injectado e a sonda de carga positiva em torno dos olhos, nariz ou queixo, ADN de condução para as regiões superficiais do colículo superior (Figura 3C) . Neste caso, a orientação do eléctrodo é um ângulo de 25-40 ° em relação à linha média. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O aspecto mais crítico para electroporação bem sucedida de células progenitoras de superfície pial são: 1) a segmentação da mistura de plasmídeo para a superfície pial; 2) evitando a geração de hematoma no local da injecção; e 3) evitar a mortalidade associada com eletroporação mesencéfalo. Apropriadamente segmentação da superfície pial é conseguido por meio de furos de medição e cuidado do crânio para evitar a penetração da superfície pial. Indevido de direcioname...

Células-tronco e progenitoras neurais estão presentes em todo o SNC de mamíferos 1, 2. A sua natureza e propriedades em zonas germinais embrionários e adultos que circundam as regiões do ventrículo do cérebro e da medula espinal tem sido extensivamente documentada na última década 1-3. Em grande parte, isso se deve ao desenvolvimento de ferramentas genéticas cada vez mais precisos, como o sistema nervoso recombinação Cre específica de alelos floxed ou retroviral linhagem rastreamento 4. No entanto, uma região-o progenitor exame abrangente pial progenitor superfície zona tem só recentemente foi descrito em detalhes 5-7 e aguarda. A superfície pial do cérebro é definida como a interface entre a superfície do cérebro e meninges circundantes 8. Durante o desenvolvimento, neuroepithelial e, posteriormente, radiais metros finais da glia anexar a esta superfície 9,10. Alguns dos abetost neurónios no cérebro humano e de muitos mitoses neuronais são observadas nesta região 11. Mais tarde, durante a neurogénese embrionário, interneurónios corticais são conhecidos para atravessar a região pial, para além das suas rotas migratórias na zona intermédia e uma zona subventricular 12-14. Durante este período, as células estaminais podem ser cultivadas a partir desta zona e que parece ser um sítio activo de neuro e gliogenesis 5. No cérebro adulto, foi relatado que interneurónios pode ser carregado a partir de progenitores de superfície pial seguinte provocação hipóxica 7. No entanto, a contribuição da região para sua a genensis durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal permaneceu obscura, em parte devido à dificuldade de investigar especificamente esta região 6. No colículo superior, e no córtex cerebral, interneurónios superficiais (ou camada I no córtex) podem modular a saída do circuito de populações de neurónios excitatórios subjacentes e, portanto, contribuir significantly para a função destas estruturas. Em particular, uma camada de interneurônios estão em posição privilegiada para regular o disparo de neurônios ao longo das camadas superiores do córtex cerebral dada a sua ampla conectividade para as camadas superficiais e profundas das colunas corticais 15,16. De maneira similar, interneurons horizontais receber entrada excitatória de fibras corticais e da retina, projeto sobre uma área relativamente grande e são especulado para mediar a inibição de populações neuronais que respondem a estímulos visuais remoto 17,18. Além disso, a sua morfologia é bem adequada para desempenhar um papel potencial na actividade das ondas modelado no desenvolvimento do sistema visual 19. Curiosamente, o desenvolvimento e maturação interneurônio acontece com um grande grau de pós-natal. Além disso, este processo de maturação foi encontrado para ser regulada por actividade neuronal e é, portanto, de um substrato de plasticidade de desenvolvimento ao longo da vida, com consequências sobre a função do circuito de 20,21. Notavelmente, nO promotores são descritos que podem objetivar especificamente essas células transgenicamente. Progenitores em divisão pode ser alvo de retrovírus 7, mas a produção do vírus é demorado e requer habilidade para produzir os títulos elevadas necessárias para a transdução de células. Eletroporação levou a um renascimento no estudo do desenvolvimento neurológico, pois permite interrogatório genético rápido e eficiente de vias de sinalização das células precursoras neurais 4, 22, 23. A electroporação envolve a injecção de DNA de plasmídeo, seguido pelo fornecimento de impulsos eléctricos para o exterior da cabeça, para conduzir unidireccionalmente do ADN nas células progenitoras que proliferam em torno dos ventrículos 4, 22, 23. Electroporation parece requerer o trânsito de células através da fase M do ciclo celular para a expressão de transgenes de plasmídeo de 24. Especificamente, descobriu-se que somentecélulas que passam por fase M dentro de 8 horas de eletroporação de plasmídeos vai expressar transgenes apesar de sua entrega efetiva de todas as células dentro de ~ 160 mM da parede ventricular 24. Especula-se que isto é devido à necessidade de repartição do envelope nuclear que permite o acesso nuclear dos plasmídeos epissomais, como produtos químicos que provocam a permeabilização nuclear pode induzir a expressão de plasmídeos nas células pós-mitóticas 25. Originalmente utilizada no embrião 22, electroporação foi adaptada para uso no cérebro pós-natal bem mais tarde 26, 27. Recentemente, nós adaptamos electroporação para utilização na manipulação genética de células progenitoras de superfície pial 6. Além disso, usando essa abordagem nós mostramos que há aparentemente duas linhagens distintas de células progenitoras na região-interneuronal e astrocitária 6. Este protocolo detalha uma maneira simples, rápida e poderosa para direcionar essas células para o interrogatóriodo desenvolvimento de mecanismos de regulação destas células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

Ao longo dos últimos anos, a superfície pial tem sido identificada como um nicho germinal da importância durante embrionário, perinatal e adulto neuro e gliogenesis, incluindo após lesão. No entanto, os métodos para interrogar geneticamente essas populações progenitoras e acompanhamento de suas linhagens foi limitada devido à falta de especificidade ou demorado produção de vírus. Assim, o progresso nesta região tem sido relativamente lento, com apenas um punhado de investigações sobre este local. Eletroporação tem sido usado por mais de uma década a estudar as propriedades de células-tronco neurais no embrião, e mais recentemente no cérebro pós-natal. Aqui nós descrevemos uma técnica eficiente, rápida e simples para a manipulação genética de células progenitoras de superfície pial com base em uma abordagem eletroporação adaptado. Pial eletroporação superfície permite a rotulagem genética fácil e manipulação desses progenitores, representando, assim, uma abordagem de economia de tempo e econômica para estudar essas células.

Pial superfície resultados electroporação na expressão do DNA de plasmídeo em células-principalmente progenitores-na ou perto da superfície pial 6. Mais especificamente, a orientação dos eléctrodos é crítica em ditar a direcção de movimento do plasmídeo e expressão subsequente. Assim, em duas configurações de eléctrodos, o plasmídeo é dirigida em cerca de um vector de recta entre o eléctrodo negativo e positivo. Portanto, se o pólo negativo é colocado sobre o local da injecção e o p?...

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Neonatal Pial Surface Electroporation

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K visualizações.  Cedars-Sinai Medical Center.  A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas. 