Os autores gostariam de agradecer o apoio do Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Award Forum, bem como os fundos do Instituto de Medicina Regenerativa de Cedars-Sinai, ea família de Guerin. O projeto descrito foi apoiado na forma de um voucher CTSI Núcleo financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, Grant UL1RR033176, e agora está no Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Grant UL1TR000124. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIH.

Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Cedars-Sinai IACUC. Os investigadores devem garantir o cumprimento IACUC institucional antes de prosseguir. Todas as ferramentas e os reagentes devem ser esterilizados antes de utilizar. 1. Preparação de Ferramentas, Soluções e Mistura DNA <ol><li> Insira 100 mm fogo borosilicato polido tubos capilares de vidro em um extrator micropipeta. Definir aquecimento para permitir a tração ponderada padrão para formar ponteira de aproximadamente 17,5 mm. Cortar pontas afiadas com tesouras cirúrgicas, a uma distância de aproximadamente 8-9 mm a partir do início da ponta para criar uma abertura de cerca de 100 um de diâmetro. </li><li> Faça um estoque de 1% w / v solução verde rápido pela mistura de água livre de nuclease filtradas (utilizando um filtro de seringa de 20 mm) com verde rápido seca. </li><li> Isolar o plasmídeo purificado de ADN livre de endotoxina que é altamente concentrada (ou seja,&gt; 3 mg / mL), diluída em Tris-EDTA (TE) de tampão. Adicionar quantidades desejadas de plasmídeoa mistura diluída em tampão TE e adicionar uma proporção de 1:10 da solução verde rápido 1% (fazendo um 0,1% w / v de concentração final de verde rápido). Use uma concentração final de 0,5-2,0 mg / mL de plasmídeo para a expressão robusta de transgenes. </li></ol> 2. Animais Anestesia, Pipeta Carregando e Pial Superfície plasmídeo Injeção <ol><li> Induzir a anestesia hipotermia em 1-2 dia ratos pós-natal, colocando-os em uma placa de Petri, que é colocado no gelo por 5-8 min (tempo dependente da idade filhote / peso). Uma vez que a hipotermia é confirmado pela falta de circulação de e / ou beliscar toe cauda reflexo, os ratos estão prontos para ser injetado. Coloque os animais de volta no gelo se reflexos da dor são evidentes. O procedimento de injeção e eletroporação levar menos de 2-3 minutos no total para que o tempo de hipotermia, injeção, e os procedimentos de eletroporação de acordo para manter a anestesia adequada. </li><li> Durante a anestesia, utilizando uma pipeta de padrão, cuidadosamente pipeta quantidade de plasmi desejard misturar a ser injetada (0,5-2 mL) sobre um pedaço de filme de cera de parafina para referência. Aqui, um volume total de 0,5 mL de mistura de plasmídeo é injectado. Em seguida, usando um injetor de micro, insira cuidadosamente montado pipeta capilar de vidro em tubo contendo mistura plasmídeo. Tenha cuidado extra para evitar a ponta de quebrar por ter certeza que ele não toque nas bordas do tubo. Aspirar a solução para a pipeta, discando-se lentamente para trás o botão de transferência. Uma vez que um volume suficiente foi carregado para a pipeta, disque para a frente até que a pressão retorna à posição neutra de 0 hPa. </li><li> Usando 300-450 hPa de pressão para injeção para assegurar a pressão adequada para um enchimento da superfície / espaço meníngea pial, coloque a ponta nas proximidades da injeção parafina referência filme pipetado (de 2,2) e usar o pedal do micro injetora para ejetar um de volume no filme cera de parafina. Ajuste a pressão de acordo até a quantidade ejetado é igual ao referenc previamente pipetadavolume de e. </li><li> Uma vez que a ponta tenha sido equilibrada e anestesia foi confirmado, os filhotes são pronta para ser injectada. </li><li> O objectivo da experiência é para injectar a mistura de plasmídeo sob o crânio e acima da superfície pial para permitir a electroporação do ADN para baixo, para os progenitores superfície pial (Figura 1A). Para injeções córtex, segurar o filhote para baixo, usando o polegar eo dedo indicador da mão menos dominante. Os hemisférios corticais e outras estruturas superficiais, tais como os colículos superiores são visíveis entre P0 e P2, permitindo a fácil orientação destas estruturas (Figura 1B). Usando mão e alvo a região dominante desejado do córtex (ou seja, motor, somatossensorial, etc), inserir pipeta passado a pele e crânio com cuidado para evitar artérias cerebrais. Certifique-se para impedir a continuação da penetração da ponta passado o crânio (o que é indicado pela ausência de uma maior resistência apenas após a perfuração do crânio). </li><li> Injetar plasmaID da solução usando o pedal do micro injetora e certifique-se dispersa uniformemente em todo o tecido (Figura 2A). Nota: É muito importante determinar empiricamente uma abordagem que maximiza a entrega plasmídeo evitando hematoma devido à pressão do fluido. Isto pode ser feito através do ajuste da duração da injecção, o ângulo, o volume, e o local alvo preciso para evitar ruptura vascular. </li><li> Não deixe de experimentar e manter a ponta de secagem entre as injeções, colocando a ponta em gotículas de teste a partir de injeções feitas anteriormente no papel de cera ou parafina filme plástico. Isto é necessário para evitar a acumulação de solução de ADN ponta evaporado e cristalizado, o que pode resultar no entupimento da ponta e volumes de entrega inconsistentes. </li></ol> 3. Eletroporação <ol><li> Defina o Electroporator para 135-150 V para cinco pulsos, com duração de 50 milissegundos, com intervalos de 950 ms entre cada pulso. A fim de aumentar a condutância eevitar a queima da pele, cobre de 3 mm tweezertrodes platina com gel de electroporação. Verifique se há reflexos beliscar dedo do pé e cauda neste momento para garantir a anestesia. Se ágil, colocar no gelo por alguns minutos para anestesiar. </li><li> Para córtex (e colículo superior) injecções, empregar um eléctrodo de 3 mm (Figura 2B) para aumentar a viabilidade das crias (em comparação com a 7 - e 10-mm eléctrodos, os quais são utilizados para a zona ventricular electroporação). Coloque a sonda carregada negativamente do eléctrodo sobre a área injectado e a sonda carregada positivamente em torno da região abaixo do olho contralateral de modo que a orientação do eléctrodo é um ângulo de 45-60 ° em relação à linha média (Figura 2C). </li><li> Utilize o pedal da electroporador para acionar corrente e mantenha tweezertrodes no local por 3-5 pulsos, dependendo da idade das crias e de peso, de forma eficaz visando DNA em células da superfície pial subjacentes quando representando curvaturados hemisférios. Nota: O pólo negativo pode ser varrida sobre a área de injecção no meio de legumes ou um eléctrodo maior pode ser utilizada para aumentar a área de electroporação. </li><li> Imediatamente após a eletroporação, cuidadosamente limpar gel de filhotes e colocá-los sob uma lâmpada de calor por cerca de 5 min. </li><li> Filhotes vai agudamente perder sua tonalidade rosa-avermelhado natural nos minutos após eletroporação devido à cianose. Observe os filhotes para a recuperação da cor natural eo início do movimento normal antes de devolvê-los para suas gaiolas. </li><li> Certifique-se de re-socialização com a mãe, observando se ela traz os filhotes de volta ao ninho e começa a preparação deles. Se ela se torna agressivo, certifique-se filhotes de cachorro não tem restos de gel e incubar-los com algumas das roupas de cama para transferir o cheiro para os filhotes. </li></ol> 4. Modificações para Segmentação do colículos superiores Segmentação: <ol><li> Inject o colículo superior, da mesma maneira como o córtex, mas notar que a região alvo encontra-se imediatamente posterior e lateral de lambda e aproximadamente na linha média (Figuras 3A e 3B). Com injecções de sucesso, a mistura de plasmídeo naturalmente enche os contornos do colículo superior. Uma vez que as injecções foram feitas com sucesso, os animais estão prontos para electroporação. </li></ol> Eletroporação: <ol><li> De uma forma muito semelhante, para injecções colículo superior, colocar a sonda carregada negativamente do eléctrodo sobre a área injectado e a sonda de carga positiva em torno dos olhos, nariz ou queixo, ADN de condução para as regiões superficiais do colículo superior (Figura 3C) . Neste caso, a orientação do eléctrodo é um ângulo de 25-40 ° em relação à linha média. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O aspecto mais crítico para electroporação bem sucedida de células progenitoras de superfície pial são: 1) a segmentação da mistura de plasmídeo para a superfície pial; 2) evitando a geração de hematoma no local da injecção; e 3) evitar a mortalidade associada com eletroporação mesencéfalo. Apropriadamente segmentação da superfície pial é conseguido por meio de furos de medição e cuidado do crânio para evitar a penetração da superfície pial. Indevido de direcioname...

Células-tronco e progenitoras neurais estão presentes em todo o SNC de mamíferos 1, 2. A sua natureza e propriedades em zonas germinais embrionários e adultos que circundam as regiões do ventrículo do cérebro e da medula espinal tem sido extensivamente documentada na última década 1-3. Em grande parte, isso se deve ao desenvolvimento de ferramentas genéticas cada vez mais precisos, como o sistema nervoso recombinação Cre específica de alelos floxed ou retroviral linhagem rastreamento 4. No entanto, uma região-o progenitor exame abrangente pial progenitor superfície zona tem só recentemente foi descrito em detalhes 5-7 e aguarda. A superfície pial do cérebro é definida como a interface entre a superfície do cérebro e meninges circundantes 8. Durante o desenvolvimento, neuroepithelial e, posteriormente, radiais metros finais da glia anexar a esta superfície 9,10. Alguns dos abetost neurónios no cérebro humano e de muitos mitoses neuronais são observadas nesta região 11. Mais tarde, durante a neurogénese embrionário, interneurónios corticais são conhecidos para atravessar a região pial, para além das suas rotas migratórias na zona intermédia e uma zona subventricular 12-14. Durante este período, as células estaminais podem ser cultivadas a partir desta zona e que parece ser um sítio activo de neuro e gliogenesis 5. No cérebro adulto, foi relatado que interneurónios pode ser carregado a partir de progenitores de superfície pial seguinte provocação hipóxica 7. No entanto, a contribuição da região para sua a genensis durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal permaneceu obscura, em parte devido à dificuldade de investigar especificamente esta região 6. No colículo superior, e no córtex cerebral, interneurónios superficiais (ou camada I no córtex) podem modular a saída do circuito de populações de neurónios excitatórios subjacentes e, portanto, contribuir significantly para a função destas estruturas. Em particular, uma camada de interneurônios estão em posição privilegiada para regular o disparo de neurônios ao longo das camadas superiores do córtex cerebral dada a sua ampla conectividade para as camadas superficiais e profundas das colunas corticais 15,16. De maneira similar, interneurons horizontais receber entrada excitatória de fibras corticais e da retina, projeto sobre uma área relativamente grande e são especulado para mediar a inibição de populações neuronais que respondem a estímulos visuais remoto 17,18. Além disso, a sua morfologia é bem adequada para desempenhar um papel potencial na actividade das ondas modelado no desenvolvimento do sistema visual 19. Curiosamente, o desenvolvimento e maturação interneurônio acontece com um grande grau de pós-natal. Além disso, este processo de maturação foi encontrado para ser regulada por actividade neuronal e é, portanto, de um substrato de plasticidade de desenvolvimento ao longo da vida, com consequências sobre a função do circuito de 20,21. Notavelmente, nO promotores são descritos que podem objetivar especificamente essas células transgenicamente. Progenitores em divisão pode ser alvo de retrovírus 7, mas a produção do vírus é demorado e requer habilidade para produzir os títulos elevadas necessárias para a transdução de células. Eletroporação levou a um renascimento no estudo do desenvolvimento neurológico, pois permite interrogatório genético rápido e eficiente de vias de sinalização das células precursoras neurais 4, 22, 23. A electroporação envolve a injecção de DNA de plasmídeo, seguido pelo fornecimento de impulsos eléctricos para o exterior da cabeça, para conduzir unidireccionalmente do ADN nas células progenitoras que proliferam em torno dos ventrículos 4, 22, 23. Electroporation parece requerer o trânsito de células através da fase M do ciclo celular para a expressão de transgenes de plasmídeo de 24. Especificamente, descobriu-se que somentecélulas que passam por fase M dentro de 8 horas de eletroporação de plasmídeos vai expressar transgenes apesar de sua entrega efetiva de todas as células dentro de ~ 160 mM da parede ventricular 24. Especula-se que isto é devido à necessidade de repartição do envelope nuclear que permite o acesso nuclear dos plasmídeos epissomais, como produtos químicos que provocam a permeabilização nuclear pode induzir a expressão de plasmídeos nas células pós-mitóticas 25. Originalmente utilizada no embrião 22, electroporação foi adaptada para uso no cérebro pós-natal bem mais tarde 26, 27. Recentemente, nós adaptamos electroporação para utilização na manipulação genética de células progenitoras de superfície pial 6. Além disso, usando essa abordagem nós mostramos que há aparentemente duas linhagens distintas de células progenitoras na região-interneuronal e astrocitária 6. Este protocolo detalha uma maneira simples, rápida e poderosa para direcionar essas células para o interrogatóriodo desenvolvimento de mecanismos de regulação destas células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

Ao longo dos últimos anos, a superfície pial tem sido identificada como um nicho germinal da importância durante embrionário, perinatal e adulto neuro e gliogenesis, incluindo após lesão. No entanto, os métodos para interrogar geneticamente essas populações progenitoras e acompanhamento de suas linhagens foi limitada devido à falta de especificidade ou demorado produção de vírus. Assim, o progresso nesta região tem sido relativamente lento, com apenas um punhado de investigações sobre este local. Eletroporação tem sido usado por mais de uma década a estudar as propriedades de células-tronco neurais no embrião, e mais recentemente no cérebro pós-natal. Aqui nós descrevemos uma técnica eficiente, rápida e simples para a manipulação genética de células progenitoras de superfície pial com base em uma abordagem eletroporação adaptado. Pial eletroporação superfície permite a rotulagem genética fácil e manipulação desses progenitores, representando, assim, uma abordagem de economia de tempo e econômica para estudar essas células.

Pial superfície resultados electroporação na expressão do DNA de plasmídeo em células-principalmente progenitores-na ou perto da superfície pial 6. Mais especificamente, a orientação dos eléctrodos é crítica em ditar a direcção de movimento do plasmídeo e expressão subsequente. Assim, em duas configurações de eléctrodos, o plasmídeo é dirigida em cerca de um vector de recta entre o eléctrodo negativo e positivo. Portanto, se o pólo negativo é colocado sobre o local da injecção e o p?...

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Neonatal Pial Surface Electroporation

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K visualizações.  Cedars-Sinai Medical Center.  A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas. 

Vídeo: Neonatal Pial Surface Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...