Aplicando diretamente o inseticida no inseto e não através do contato superficial, há uma variação mínima na exposição a inseticidas, e isso nos permite medir o perfil de suscetibilidade das populações de mosquitos com mais precisão. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite calcular doses letais relativizadas em massa de um inseticida em vez de concentrações letais, o que melhora muito as comparações de razão de resistência. Tenha cuidado para armazenar os inseticidas corretamente, evite contaminar suas ferramentas e certifique-se de que as peças de seringa estejam em boa forma.
Isso vai ajudá-lo a obter resultados consistentes. Para começar, remova as soluções necessárias de inseticidas do congelador. Imediatamente vórtice da solução ou inverter cinco vezes, e colocá-la em um recipiente resistente à luz à temperatura ambiente para deixar os inseticidas aquecer à temperatura ambiente antes de usar.
Coloque cinco tubos de microcentrifus de microcentragem com 0,5 mililitros de acetona cada. Encha o barril de seringa completamente com acetona do primeiro tubo. Em seguida, expelir a acetona em um recipiente de resíduos empurrando rapidamente para baixo no êmbolo, e repita mais quatro vezes para completar um total de cinco lavagens de acetona da mesma alíquota de acetona.
Em seguida, encha o barril de seringa completamente com ar, e expulse o ar e potenciais restos de acetona para dentro do recipiente de resíduos. Repita mais duas vezes para completar três lavagens com ar. Crie um bolsão de ar dentro do cano entre o êmbolo da seringa e o topo da agulha puxando o êmbolo de aproximadamente cinco milímetros para dentro do barril.
Rotule os copos de plástico com a ID aleatória para avaliação de mortalidade cega. Usando um aspirador alimentado por sucção por inalação, aspire o número desejado de mosquitos adultos de três a cinco dias de idade. Coloque a ponta do aspirador no tubo com algodão enrolado na ponta.
Exale suavemente e toque no aspirador para transferir os mosquitos para um tubo cônico. Use o algodão para tampar o tubo quando a ponta do aspirador for removida e, em seguida, tampar com a tampa. Derrube brevemente os mosquitos nos tubos, colocando-os por um mínimo de 10 minutos a quatro graus Celsius ou enterrando-os sob o gelo em uma bandeja de gelo.
Transfira os mosquitos derrubados para a tenda de manuseio de insetos. Coloque cuidadosamente os mosquitos em uma bandeja de plástico colocada no gelo, e despeje cerca de 50 mosquitos de cada vez para garantir que cada um toque na bandeja fria abaixo dela e permaneça derrubado. Classifique os mosquitos por sexo, pegando-os suavemente pelas pernas ou asas com fórceps, seguido de colocar cada sexo em um copo de retenção separado, e parar quando o número desejado for atingido.
Durante a triagem, remova todos os mosquitos que estejam feridos ou sejam extra grandes ou pequenos. Para registrar o peso do copo de mosquito, coloque um copo vazio com uma placa de Petri como uma tampa na balança, e coloque a balança. Despeje os mosquitos no recipiente e coloque a tampa em cima.
Coloque o recipiente na balança e regise o peso final, juntamente com o número de mosquitos. Coloque imediatamente a xícara de espécimes de volta no gelo para mantê-los imobilizados até que todas as xícaras do espécime sejam pesadas. Divida os mosquitos preparados em cinco a 10 xícaras separadas colocadas no gelo, rotuladas com identidades aleatórias.
Use pinças e um contador portátil para alcançar 20 a 25 mosquitos por xícara. Para classificar as moscas das frutas, anestesiar as moscas usando dióxido de carbono por sete segundos. Despeje as moscas em uma bolsa de gelo embrulhada em papel de banco.
Usando um pincel fino, separe e conte os machos e fêmeas. Use o pincel para pegar suavemente as moscas escolhidas e colocá-las em uma garrafa de estoque limpa e vazia. Depois de escolher o mesmo número de moscas de frutas machos e fêmeas, rotule as garrafas de estoque com o nome da cepa e o total da mosca da fruta.
Anestesiar a garrafa de moscas de frutas usando dióxido de carbono por sete segundos. Despeje as moscas da fruta sobre o papel de pesagem, e use o papel como funil para introduzir as moscas em um frasco tared rotulado com uma ID aleatória.Depois de colocar a tampa da placa de Petri em cima do frasco de moscas de frutas, coloque-a na balança. Registo o peso combinado e o número de espécimes na folha de pontuação.
Coloque imediatamente o frasco de moscas de frutas em uma bandeja de gelo com a tampa ainda em cima para evitar que as moscas escapem. Carregue a seringa com a concentração adequada de inseticidas, começando com a dose menos concentrada e trabalhe para a dose mais concentrada com cada grupo de organismos. Coloque os espécimes sobre papel de pesagem colocado em cima de uma bandeja no gelo.
Separe os espécimes que estão próximos usando um pincel limpo sem inseticidas ou um cotonete de algodão para permitir fácil acesso a cada espécime para dosagem. Utilizando a seringa, aplique uma gota de solução de inseticida no tórax ventral e na área do abdômen para mosquitos e dorso para moscas frutíferas. Despeje imediatamente os espécimes de volta no copo de plástico rotulado.
Cubra o copo com rede e um elástico. Observe que um espécime atualizado conta com o copo se algum espécime foi morto, danificado ou escapou neste processo. Coloque o copo completo em uma bandeja de retenção.
Para a primeira xícara, registo o tempo em que a dosagem é concluída. Repita a dosagem para cada xícara até que todos os espécimes tenham sido dosados com as concentrações adequadas de inseticidas, e regise o tempo final quando todos os espécimes tiverem sido dosados. Forneça 10% de solução de sacarose para cada xícara através de uma bola de algodão molhado, e armazene os mosquitos e moscas de frutas na temperatura e umidade desejadas.
Registo da mortalidade por amostra em 24 horas após o início da exposição a inseticidas. Classificar os mosquitos como vivos se eles podem voar e se manter em pé e mortos se eles são imóveis ou ataxicos, como descrito pela OMS. Siga a mesma avaliação de mortalidade para moscas frutíferas.
Após a realização do bioensaio, foram obtidos dados de resposta de dose com duas cepas que são o genótipo Rockefeller e IICC para o Aedes aegypti masculino e feminino. A dose letal mediana relativizada em massa para Rockefeller e IICC foi de 0,008 e 0,336 nanogramas por miligrama, respectivamente. Os resultados não revelaram diferenças entre as curvas de resposta da dose de mosquitos femininos e machos dentro de cada cepa.
Portanto, os dados de ambos os sexos foram combinados para calcular os valores médios da dose letal. Como os intervalos de confiança de 95% para a dose letal mediana dessas duas cepas não se sobrepuseram, esses valores foram considerados significativamente diferentes. Além disso, ao calcular as razões resistentes, a cepa IICC foi mais de 40 vezes mais resistente do que a cepa Rockefeller suscetível.
Também foram obtidos dados de resposta de dose para mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, cepa Canton-S, e a dose letal mediana relativizada em massa foi encontrada em 0,213 nanogramas por miligrama. A consistência é fundamental, especialmente ao armazenar e aplicar o inseticida e avaliar a mortalidade. Além disso, tome cuidado ao manusear a amostra para evitar danos ou morte não induzida pelo inseticida.
Com este método, podemos agora determinar com precisão a resistência técnica de uma população de mosquitos e como as condições ambientais impactam a resistência ou como a resistência técnica prevê resistência prática.
