Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na epigenética e no campo de desmetilação de 5-metilcittosina mediada por TET2, como uma análise da atividade de mutações TET2 normais e clínicas. A principal vantagem dessa técnica é que o TET2 nativo pode ser purificado em uma única etapa, e sua atividade pode ser analisada em termos de formação dos três produtos. Vários estudantes de pós-graduação estarão demonstrando o procedimento.
A purificação da proteína será realizada por Chayan Bhattacharya, o ensaio TET2 de Aninda Sundary Dey, e a análise LC-MS/MS por Navid Ayon. Para transformação bacteriana, adicione um microlitro de células de expressão de destino recombinante pDEST 14 contendo dioxigenase tet2 humana não marcada a 100 microlitrais de células E.coli BL21 DE3 quimicamente competentes em um tubo de 1,7 mililitro. Após a incubação no gelo por pelo menos 15 minutos, o calor choque a mistura a 42 graus Celsius por 30 segundos em um banho de água.
Imediatamente após o choque térmico, coloque as células de volta no gelo por um mínimo de dois minutos. Depois disso, adicione 250 microliters de caldo super ideal com repressão catabólica às células. Incubar as células bacterianas por uma hora a 37 graus Celsius em um shaker.
Após a incubação, gire as células centrifugando o tubo a 9.000 vezes a gravidade por um minuto. Descarte 70% do supernatante por pipetação e dissolva a pelota na mídia restante. Espalhe a suspensão celular em uma placa de ágar de caldo lirua contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro.
Incubar a placa por 16 horas a 37 graus Celsius. Selecione uma colônia isolada e inocula-a em 10 mililitros de mídia de ampicilina LB. Incubar o tubo a 37 graus Celsius em um shaker durante a noite.
Depois disso, use 100 microliters de cultura bacteriana para inocular 100 mililitros da mídia de ampicilina LB como cultura primária. Incubar o tubo a 37 graus Celsius em um shaker durante a noite. No dia seguinte, inocular 15 frascos, cada um contendo 600 mililitros de mídia de ampicilina LB com seis mililitros de cultura primária por frasco.
Incubar os frascos a 37 graus Celsius em um shaker a 180 RPM. Para verificar a densidade da cultura bacteriana, meça sua densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD600, usando um espectrofotômetro. Após a cultura atingir uma densidade de 0,8 em OD600, induzir a expressão da proteína TET2 com 300 microliters de um IPTG molar em cada frasco, e crescer a cultura por mais 16 horas a 17 graus Celsius.
Após a incubação, transfira a cultura bacteriana para garrafas centrífugas. Centrifugar a cultura bacteriana expressando a enzima TET2 a 5.250 vezes a gravidade por 45 minutos. Use a pelota bacteriana para purificação TET2.
Trabalhando em gelo ou a quatro graus Celsius, suspenda a pelota bacteriana em 100 mililitros de 50 mililitros de tampão MES de 50 mililitros, pH seis. Em seguida, pegue cinco mililitros da suspensão da célula, e leve-o para 45 mililitros com o buffer. Sonicar a suspensão por cinco vezes 30 segundos na potência 20, com intervalos de resfriamento de 60 segundos.
Gire o lise em 5.250 vezes a gravidade por 45 minutos. Colete o supernatante contendo a enzima TET2 solúvel e passe-a através de filtros de 0,45 mícrons antes de carregar em um sistema FPLC. Embale 30 mililitros de uma forte resina de troca de cation em uma coluna FPLC.
Equilibre a coluna com 10 volumes de tampão de lavagem na taxa de fluxo constante de 0,3 mililitros por minuto usando um sistema FPLC. Carregue o lise clarificado na coluna pré-equilibrada e lave com aproximadamente 10 volumes de tampão de lavagem até que o fluxo fique claro. Elute TET2 usando um gradiente de zero a 10% do tampão de lavagem para o tampão de elução em 15 volumes de cama, seguido por um porão de 10% de eluição para dois volumes de cama.
Colete 100 amostras de microliter de lisecelular antes e depois do carregamento da coluna, juntamente com todas as frações de elução, e analise em gel SDS-PAGE 10% resolvendo. Acumule as frações contendo proteína TET2 e congele a proteína. Em seguida, dissolva a enzima em 10 mililitros de água, e armazene a menos 80 graus Celsius.
Realize todas as reações de desmetilação em triplicado com três microgramas de substrato. Adicione 100 microgramas de enzima TET2 purificada a 50 microliters de tampão de reação total. Após uma hora de incubação a 37 graus, sacie as reações de oxidação catalisadas TET2 com cinco microliters de 500 mililitros EDTA.
Para preparar amostras para análise, separe o DNA da mistura de reação TET2 adicionando primeiro 100 microliters de buffer de ligação Oligo a 55 microliters de reação saciada. Na sequência, adicione 400 microliters de 100% de etanol à mistura. Passe esta mistura através de uma coluna de ligação Oligo.
Depois de lavar o DNA vinculado com 750 microliters de tampão de lavagem, elute o DNA em 20 microliters de água. Agora, digerir o DNA isolado com duas unidades de DNase I e 60 unidades de nuclease S1 a 37 graus Celsius por 12 horas para produzir monofosfatos nucleosídeos individuais. Após a digestão, adicione duas unidades de fosfatase alcalina intestinal da panturrilha às amostras.
Incubar por uma adição de 12 horas a 37 graus Celsius para remover os grupos de fosfato terminal dos monofosfatos nucleosídeos, e obter os nucleosídeos. Prepare uma solução de estoque de 100 micromolar de todos os nucleosídeos de citosina modificadas e as bases normais de DNA na água de grau HPLC para o desenvolvimento do método LC-MS/MS. Otimize os parâmetros de MS/MS dependentes de nucleosídeos infundindo soluções de estoque uma de cada vez no espectrômetro de massa a uma taxa de fluxo de 10 microliters por minuto no modo de varredura de MS aprimorado.
Vários parâmetros podem ser otimizados usando o recurso automatizado de otimização quantitativa do software para cada nucleosídeo de DNA. Neste ponto, otimize os parâmetros restantes para cada nucleosídeo de DNA usando o recurso de otimização quantitativa manual do software no modo de análise de injeção de fluxo. Agora, otimize os parâmetros de MS/MS dependentes da fonte injetando 10 microliters de solução de estoque usando um gradiente com 25% de solvente B a uma taxa de fluxo de 0,3 mililitros por minuto.
Para separar todos os oito núcleos de DNA, realize a cromatografia líquida conforme detalhado no protocolo de texto em uma coluna C18. Finalmente, detecte e quantifique todos os nucleosídeos usando o método LC-MS/MS em curvas padrão. Uma vez que o domínio catallítico do TET2 tem um ponto isoelétrico relativamente alto em comparação com a maioria das proteínas E.coli indígenas, desenvolveu-se um processo eficiente de purificação utilizando uma cromatografia de troca de cation.
Esta purificação rendeu uma enzima TET2 maior que 90% pura em um único passo. A fim de separar e quantificar diferentes derivados desoxicytidinas e as quatro bases naturais de DNA após a reação enzimática TET2, um ensaio sensível baseado em LC-MS/MS foi otimizado. As curvas padrão foram desenhadas utilizando diluições seriais de uma mistura contendo todos os nucleosídeos.
Os resultados do método de cromatografia líquida MS/MS são mostrados aqui. O método permite a separação e quantificação das quatro bases normais de DNA, bem como as quatro bases de citosina modificadas. Neste procedimento experimental, descrevemos a clonagem de domínio catalítico de dioxína de dioxinoase humana não grampeado usando técnica de recombinação específica do local e uma expressão suficiente em um vetor de destino em E.Coli.
Purificamos eficientemente a enzima TET2 não marcada utilizando cromatografia de troca de cation para produzir maiores de 90% de pureza em um único passo. Além disso, desenvolvemos um novo método de cromatografia líquida para separar as quatro bases normais de DNA e as quatro bases de citosina modificadas. Para quantificar os oito nucleosídeos das reações catalisadas do TET2, acoplamos nosso método de cromatografia líquida melhorado com espectrometria de massa tandem.
O ensaio sensível LC-MS/MS foi então utilizado para determinar a atividade da enzima TET2 humana recombinante. A abordagem descrita aqui aumentará muito a valorização da dioxigenase TET2 do tipo selvagem e mutante.
