Neste protocolo, demonstramos o processo de purificação para obter canais TRP purificados e completos, que é o primeiro passo necessário para estudar propriedades eletrofisiológicas, e obter informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo. Com base no mecanismo de amostragem do complexo proteico INAD e usando contas de níquel de baixo custo com capacidade muito maior, a quantidade suficiente de canais TRP pode ser purificada a partir de cabeças de mosca. Demonstrando o procedimento será Yuyang Liu, um técnico do nosso laboratório.
Para começar, transforme o pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 plasmid em células E.coli BL21, usando o método de transformação do choque térmico do cloreto de cálcio. Inocular uma única colônia em 10 mililitros de luria Bertani médio, e crescer durante a noite a 37 graus Celsius. Adicione os 10 mililitros de cultura de semeadura em um litro de luria Bertani média e incubar a 37 graus Celsius.
Após a densidade óptica das células atingir 0,5, esfrie as células a 16 graus Celsius, e adicione 0,1 milimolar isopropílico-beta-D-1-thiogalactopyranoside. Após a superexpressão, pelota um litro de células cultivadas por centrifugação, e resuspend em 40 mililitros de soro fisiológico tamponado com fosfato. Carregue as células resuspended em um homogeneizador de alta pressão, pré-resfriado a quatro graus Celsius.
Aumente lentamente a pressão do homogeneizador para 800 bar. Abra a guia de entrada e deixe as células resuspensadas passarem circularmente por uma válvula com fendas estreitas. Carregue cinco mililitros de contas de glutationa em uma coluna de fluxo de gravidade, e lave as contas com 50 mililitros de tampão salino tampão salino tampão tampão tampão salino tamponado com fosfato, por um total de três vezes.
Centrifugar a célula do homogeneizador de alta pressão a 48,384 vezes G.Adicione cerca de 40 mililitros do supernatante do lise celular centrifugado às contas de glutationa equilibradas na coluna de fluxo gravitacional, e incubar por 30 minutos a 4 graus Celsius. Resuspend as contas de glutationa a cada 10 minutos. Após 30 minutos de incubação, abra a guia de saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo.
Descarte a fração de fluxo e enxágue as contas restantes de glutationa duas vezes, com 50 mililitros de tampão salino tampão salino tampão tampão-sal protegido por fosfato. Adicione 15 mililitros de tampão de elução às contas de glutationa e resuspenque as contas a cada 10 minutos. Elute o fragmento TRP 1261-1275 com etiqueta GST em um tubo cônico de 50 mL, e carregue-o em uma coluna de exclusão de tamanho.
Colete cinco mililitros das proteínas elucidadas por tubo, e concentre os fragmentos purificados em um mililitro por centrifugação em uma coluna de rotação de ultrafiltração em uma centrífuga refrigerada. Para purificar o fragmento NORPA 863-1095 marcado, siga o procedimento previamente demonstrado usando contas de níquel. Colete moscas adultas em tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros e congele-as em nitrogênio líquido por 10 minutos.
Agite vigorosamente os tubos congelados à mão e transfira a mistura para três peneiras de aço inoxidável pré-resfriadas. Agite as peneiras e varrer as cabeças de mosca da peneira de 40 malhas usando um pincel. Transfira-os para cinco tubos cônicos mililitros e armazene-os a menos 80 graus Celsius.
Homogeneize 0,5 gramas de cabeças em nitrogênio líquido usando uma argamassa pré-resfriada e pilão. Dissolva as cabeças homogeneizadas em cinco mililitros de tampão de lise 10X, seguido de centrifugação a 20,817 vezes G a quatro graus Celsius por 20 minutos. O supernante de rotação é ainda mais centrifutado 100.000 vezes G a quatro graus Celsius por 60 minutos.
Adicione um mililitro de contas de níquel na coluna de fluxo de gravidade, e lave as contas três vezes com 10 mililitros de água dupla destilada a quatro graus Celsius. Equilibre as contas com 10 volumes de coluna de tampão de lise, três vezes a quatro graus Celsius. Adicione 500 microlitadores de 600 micromolar purificados sua proteína NORPA 863-1095 na coluna de níquel, e incubar a coluna.
Resuspend as contas a cada 10 minutos. Abra a torneira da saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo e lave as contas de níquel com 10 mililitros de tampão de lise fria. Em seguida, adicione o supernatante frio da cabeça de Drosophila homogeneizar na coluna de níquel.
Após a incubação, lave as contas com 10 mililitros de tampão de lise e adicione 500 microliters de 600 micromolars de TRP 1261-1275 com etiquetas GST nas contas. Recolhe a fração elucida da coluna de gravidade. Lave as contas de níquel com 10 mililitros de tampão de ligação.
Em seguida, adicione o tampão de eluição e colete a fração de elução da coluna de fluxo de gravidade. Concentre as frações eluidas da purificação do canal Drosophila TRP, usando uma coluna de giro de ultrafiltração de quatro mililitros. Injete a amostra na coluna de exclusão de tamanho e eute as proteínas com uma taxa de fluxo razoável.
O fragmento TRP 1261-1275 com marca GST foi expresso em células E.coli e purificado usando contas de glutationa e uma coluna de exclusão de tamanho. Da mesma forma, o fragmento NORPA 863-1095 marcado foi expresso e purificado usando contas de níquel e coluna de exclusão de tamanho. O canal TRP elucido é separado do peptídeo TRP 1261-1275 com etiqueta GST, por cromatografia de exclusão de tamanho.
Como subproduto, os complexos inad, ePKC, NORPA 863-1095 são obtidos após a competição de peptídeos TRP 1261-1275. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este protocolo, é homogeneizar as cabeças de mosca em nitrogênio líquido e resolver o homogeneato no buffer contendo um detergente chamado DDM. Após este procedimento, também podemos purificar todo o complexo proteico INAD que pode ser usado para estudar seus mecanismos de montagem e regulação.
Uma possível aplicação futura deste método será estudar as informações estruturais do canal Endogenous Drosophila TRP usando técnicas Cryo-EM. Além disso, a medição das propriedades eletrofisiológicas dos canais de TRP endógenos e endógenos purificados em membrana lipídica bicamada artificial também é viável.
