Apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China bolsas, 31522029, 31770929 e 31371149 (para Haitao Wu), programa 973 (2014CB542203) do programa estadual de desenvolvimento chave para a pesquisa básica da China (a Haitao Wu) e Grant Z161100000216154 do Beijing Municipal ciência e tecnologia Comissão (Haitao Wu). Os autores agradecer todos os membros do laboratório Haitao Wu para seu encorajamento e discussões. Os autores são extremamente gratos ao Zhenwei Liu por sua ajuda com o aparelho de depuração.

Procedimentos experimentais animais seguiram as orientações institucionais de Pequim Instituto de básico ciências médicas (Beijing, China) e os regulamentos governamentais chineses para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Os ratos (adulto masculino, 26 ~ 30 g) foram instalados e mantidos a uma temperatura constante de 23 ° C, com água e comida ad libitum, sob um ciclo escuro do luz/12-h 12-h (luzes acesas às 07:00). Todos os procedimentos experimentais foram realizados durante o ciclo de luz.
1. Preparação cirúrgica
Nota: Um eletrodo personalizado foi caseiro usando o método modificado de Halpern relatório23.
<ol><li>Use 2 microfios de cobre (com um diâmetro externo de 200 µm) como o eletrodo bipolar paralelo. Enrole os eléctrodos em torno de si para formar eletrodos cilíndricos para a estimulação. Nota: Aqui, o comprimento do eletrodo dentro do PP ou DG era variado de acordo com a profundidade anatômica do núcleo.</li>
	<li>Esterilize os eletrodos usando um gabinete de desinfecção de óxido de etileno. Manipular e armazenar os eléctrodos de microfio 2 canais caseiros sem qualquer contaminação. Os eléctrodos devem ser rigorosamente esterilizados antes de qualquer implantação cirúrgica.</li>
	<li>Autoclave os instrumentos cirúrgicos.</li>
	<li>Antes da cirurgia, injete o mouse com pentobarbital (20-50 mg/kg) intraperitonealmente, para alcançar um plano cirúrgico da anestesia.</li>
	<li>Injete o mouse com suspensão estéril penicilina G procaína (75.000 U, I.M.) e um agente analgésico (carprofeno, 0,05 - 1 mg/kg, SC) para diminuir o risco de infecções e dor, respectivamente,24.</li>
	<li>Após a anestesia do animal, aplique um lubrificante de olho para ambos os olhos para evitar ressecamento do olho. Certifique-se a indução de sedação e a profundidade da anestesia por reflexos do animal em resposta a toe beliscar e prosseguir com a operação somente quando não há resposta ocorre. Nota: Vet pomada é outra opção para evitar ressecamento do olho.</li>
	<li>A maioria do pelo no topo da cabeça de rato a barba com máquina de cortar cabelo elétrica ou uma lâmina de barbear, esterilizar a área depilada com três esfrega alternadas de 70% de álcool e betadine solução e prosseguir com a operação, depois do betadine seca na pele.</li>
</ol>2. alta frequência estimulação cirurgia25,26
Nota: Nesta etapa, é um eletrodo implantado unilateralmente para a DG dorsal ou medial área PP, uma parte do hipocampo com cargos críticos na aprendizagem episódica e a memória.
<ol><li>Coloque o mouse anestesiado sobre a armação estereotáxica. Para manter a cabeça do rato imóvel, alinhar as barras de ouvido corretamente e instalá-los rapidamente. Aperte suavemente as barras de orelha para que eles oferecem suporte a cabeça centrada e segura o mouse um pouco.</li>
	<li>Use uma almofada termostática para manter a temperatura do corpo do animal a 37 ± 0,5 ° C.</li>
	<li>Use a pinça para agarrar a pele anterior orelhas de rato e cortá-lo com uma tesoura esterilizada para remover sobre área de 1 cm2 de pele no topo do crânio do rato. Nota: Uma pequena quantidade de sangramento pode ser observada ao longo das bordas da pele cortada.</li>
	<li>Retire o músculo e outro anexo sobrejacente do crânio com um cotonete de algodão para expor a superfície do crânio. Utilize um cotonete de algodão e dissecação formão para limpar todas periósteo, tendões e tecido conjuntivo de superfície completamente para identificar o sagital do crânio e linhas de suturas de lambda.</li>
	<li>Identifica o bregma e o lambda ponto. A interseção da sutura coronal e a sutura sagital na porção média superior da calvaria é onde se encontra o bregma. A interseção da sutura lambdoid pela sutura sagital é onde o lambda é visível. Use o bregma como o ponto original para definir a posição do núcleo.</li>
	<li>Após a identificação da posição de bregma e o lambda no crânio, ajuste estes dois pontos no nível horizontal. Certifique-se que a altura destes dois pontos é quase o mesmo no sentido dorso-ventral (erros devem ser < 0,05 mm). Além disso, certifique-se de que o crânio é de nível na direção médio-lateral na mesma maneira26.</li>
	<li>Para uma cirurgia unilateral, monte um caseiro 2-canal cobre microarame eletrodo no porta-eletrodo rotativo na armação estereotáxica cirúrgica.</li>
	<li>Coloque o eléctrodo verticalmente acima do ponto de bregma em primeiro lugar e defini-lo como o site original. Use o digital exibida estereotáxico quadro cirúrgico para indicar o ântero-posterior (AP), médio-lateral (ML), e dorso-ventral (DV) posições. Nota: Para evitar que o eletrodo ficar dobrada, não toque a ponta do eletrodo sobre o crânio durante a operação.</li>
	<li>Mova o eletrodo suavemente para a posição correcta (figura 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 para DG e AP-3.8/ML ± 3.0 para PP, respectivamente)27 acima do crânio sem qualquer toque. Quando o site desejado foi identificado para a inserção do eléctrodo, utilize os ajustes dorsoventral estereotáxico para maior o suporte de eletrodos e marcar a posição com um marcador preto. Nota: A localização exata em referência as coordenadas estereotáxicos pode variar por sexo, peso e tensão de rato. Ratos adultos do mesmo sexo devem ser usados para minimizar qualquer variação no local. Se possível, pré-operacional exames anatômicos devem ser usados para identificar o local em um assunto individual base27.</li>
	<li>Use uma broca Hand-Held micromanipulador-assistida (burr tamanho = 0,5 mm) para fazer buracos no crânio na posição marcado precisamente. Esterilize a ponta da rebarba com etanol a 70% antes da perfuração. Mova para cima a mini broca através do crânio ao longo do eixo z 0.8 - 1.0 mm sem alterar sua posição X-Y. Use um algodão estéril para parar qualquer sangramento durante a operação. Nota: Para evitar excesso de perfuração e excessiva geração de calor durante a perfuração, certifique-se a velocidade de rotação é 15.000-18.000 rotações por minuto (RPM) e frequentemente retirar a broca de trepanação cada 8-10 s.</li>
	<li>Manter a perfuração até a dura-máter é exposta. Utilize uma agulha torta para remover quaisquer restos de osso que são gerados durante a perfuração e fazem um furo sobre a dura-máter sem danificar o tecido de cérebro mole subjacente. Nota: Para evitar danificar o tecido cerebral, a agulha romba torta também pode ser substituída com uma pinça bem contundente.</li>
	<li>Para confirmar que a trepanação foram feita corretamente na posição desejada, reduzir a altura do eletrodo por um ajustamento do quadro de cirurgia estereotáxica e certifique-se de que o eletrodo pode ser inserido suavemente através do orifício de trépano sem tocar os obstáculos. Em caso afirmativo, inserir lentamente os eletrodos a uma profundidade de 1,8 mm para a DG (ou 3,0 mm para o PP) da superfície do crânio localizado no PP medial para a DG (PP-DG). Nota: Limpe qualquer líquido cefalorraquidiano ou saídas de sangue da trepanação com algodão estéril durante o processo de implantação do eletrodo.</li>
	<li>Depois de inserir o microfio eléctrodo no orifício do crânio, segure-o no lugar com cimento dental adequado, utilizando uma espátula pequena. O cimento rarefaz, moldá-lo ao redor do eletrodo inserido e parafusos para formar um belo boné liso. Debride e desinfectar as bordas da ferida.</li>
	<li>Desengate o elétrodo do porta-eletrodo. Retire o mouse da armação estereotáxica e devolvê-lo para uma gaiola quente. Nota: Após a cirurgia, espera-se com o retorno dos animais à suas gaiolas até que eles tenham recuperado da anestesia com consciência suficiente.</li>
	<li>Deixe o mouse mover-se livremente e deixe-o recuperar por 2 dias na gaiola. Em seguida, conecte o eletrodo implantado no rato do cérebro de um estimulador programável através de leva. Configura a interface do software, tal como apresentado na Figura 2. Definir os parâmetros HFS como 6 séries de 6 trens de 6 pulsos a 400 Hz (Figura 1B, 100 ms entre os trens, 20 s entre as séries)28. Defina a intensidade de estimulação para 200 μA.</li>
	<li>Entrega um HFS para o período desejado de tempo conforme definido. Entregar a estimulação 2 x por dia às 08:00 e às 20:00</li>
	<li>Para o grupo de controle, implante de eletrodos nos ratos e não realizar uma estimulação.</li>
	<li>Para a coloração de c-fos , estimular os ratos experimentais aguda (2x por dia). Para a rotulagem de BrdU, divida os ratos experimentais em um grupo de estimulação aguda (aplicado 2x por dia) e um grupo de estimulação crônica (aplicada x 10 em 5 dias, 2x por dia). Durante o curso da estimulação, certifique-se que o mouse está acordado. Lembre-se de assegurar que os contatos não estão torcidos. Nota: No último dia do procedimento, os ratos no grupo de estimulação aguda foram estimulados simultaneamente.</li>
	<li>Quando a estimulação é feita, cuidadosamente desconecte o pino do eletrodo o eléctrodo e o conector do sistema de gravação.</li>
</ol>3. imunofluorescência coloração e Bromodeoxyuridine rotulagem29
<ol><li>Para o c-fos e coloração Notch1, cerca de 3 h após o último estímulo HF-DBS, anestesiar os ratos injetando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para alcançar um plano cirúrgico da anestesia.</li>
	<li>Para a rotulagem de BrdU, cerca de 12 h após o último estímulo HF-DBS, dê 6 injeções de BrdU para o controle e os ratos estimulados em intervalos de 2-h (50 mg/kg em soro fisiológico a 0,9%, I.P.). 36 h após a última injecção, anestesiar os ratos injetando pentobarbital (20-50 mg/kg, I.P.) para alcançar um plano cirúrgico.</li>
	<li>Faça incisões usando um bisturi pela caixa torácica para expor o coração e passar uma agulha de calibre 22 perfusão contundente para o ventrículo esquerdo. Faça uma pequena incisão no átrio direito. Transcardially-perfundir com 50 mL de frio fosfato salino (PBS) seguido por 50 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) em 1X PBS (pH 7,4). Nota: Mude a PBS para o PFA quando o rato sangue na vivo é substituído e o fluido corre claro. Uma boa perfusão pode ser julgado pelo esclarecimento do fígado. A perfusão deve ser interrompida uma vez que foram observados30tremores de fixação.</li>
	<li>Decapitar o mouse com tesouras oftálmicas, fazer uma incisão na pele e expor o crânio. Usando fórceps, lascar-se ligeiramente fora do crânio e cuidadosamente dissecar o cérebro de rato inteiro. Post-ﬁx do cérebro em paraformaldeído 4% por mais 2 dias e transferi-lo para uma solução de 30% de sacarose a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Usando um criostato, corte o cérebro em secções coronais de 20 µm. Transferência e montar as seções para a lâmina de vidro com uma escova e armazená-los a-20 ° C. Nota: Animais com misplacements eletrodo ou danos mecânicos excessivos serão excluídos da análise posterior.</li>
	<li>Transferir os slides em PBS normal (0,1 M, pH 7,4) não contendo nenhum fixador. Lave as fatias com PBS para 3-4 x por 5 min cada para remover qualquer excesso fixador. Para o grupo de BrdU-etiquetadas, incubar as secções no 2-N HCl por 30 min a 37 ° C e lavá-los em um tampão de borato de 0,1 M (pH 8,4; 10 min). Em seguida, lave as fatias 2 x por 5 min em PBS. Nota: Immunostaining então é executada.</li>
	<li>Trate as fatias de incubação em solução (soro de cabra normal de 1%, 3% albumina de soro bovino < BSA >, 0,5% Triton X-100 e 0,02% de azida de sódio em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente (RT) de bloqueio.</li>
	<li>Incube as fatias com anti -c-fos polyclonal do anticorpo (1: 500; coelho), anticorpo anti-Notch1 (01:50; cabra) ou anticorpo anti-BrdU (1:800; rato) na solução de bloqueio a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lave as fatias 3 x em PBS, incube-os então com Alexa Fluor 568-conjugado anticoelho (1: 500), Alexa Fluor 488-conjugado anticabra (1:1, 000), ou anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 anti-rato (1: 500) por 1h no RT</li>
	<li>Lavar as amostras 3 x em PBS (10 min cada vez). Cobrir as seções do cérebro imuno-rotulados usando um meio de montagem antidesbotamento reagente contendo DAPI. Deixe as fatias de secar ao ar e armazená-los, protegido da luz a 4 ° C.</li>
	<li>Adquira imagens das áreas dos lados do cérebro com um multi-canal de alta resolução (sequencial) microscópio confocal estimuladas e unstimulated hippocampal. Defina os parâmetros de imagem consistentemente entre os grupos experimentais e controle.</li>
	<li>Executar uma imagem de mosaico usando um objectivo de alta ampliação (20 X ar objetivo, at 0,45) para adquirir contínua 3D (XYZ) imagens de campos adjacentes de visão usando o palco motorizado e utilizar software apropriado para costurá-los juntos para fazer grande composição imagens. Nota: Funções de telha incluem verdadeira costura e suavização de opções para imagens sem emenda melhoradas. Rapidamente e facilmente, imagens compostas são preparadas usando a função de costura, para formar uma imagem sobre uma vasta área.</li>
	<li>Para c-fos e coloração Notch1, realizar uma análise quantitativa de núcleos positivos da imunofluorescência densidade21 das imagens costuradas. Aleatoriamente, selecione 3 áreas nas sub-regiões hippocampal rostrais, dorsais e ventrais do DG e medir a densidade de imunofluorescência de forma duplo-cego usando Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.</li>
	<li>Para um BrdU rotulagem, analise as fatias em torno do ponto de perfuração através do hipocampo dorsal (-1,70 mm a-2,70 mm em relação ao bregma) de modo duplo-cego.</li>
	<li>Conte apenas positivo BrdU neurônios em DG. Incluem as células deitado dentro de diâmetros de 2-célula da célula grânulo na contagem. Nota: Aqui, contando foi realizada usando um 40 X objetivo de ar. Aleatoriamente, 3-5 seções por animal foram contadas, e as contagens foram em média e expressa como meio por DG19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Perlmutter, J. S., Mink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation.">Deep brain stimulation.</a> Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).</li><li>Lozano, A. M., Lipsman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+and+regulating+dysfunctional+circuits+using+deep+brain+stimulation.">Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation.</a> Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).</li><li>Kohl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+for+treatment-refractory+obsessive+compulsive+disorder:+a+systematic+review.">Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review.</a> BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).</li><li>Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+effects+of+deep+brain+stimulation+for+treatment-resistant+major+depression.">Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression.</a> Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).</li><li>Fisher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+the+anterior+nucleus+of+thalamus+for+treatment+of+refractory+epilepsy.">Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).</li><li>Greenberg, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+of+the+ventral+internal+capsule/ventral+striatum+for+obsessive-compulsive+disorder:+worldwide+experience.">Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience.</a> Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).</li><li>Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+for+Parkinson's+disease+and+other+movement+disorders.">Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders.</a> Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).</li><li>Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+stimulation+in+Parkinson's+disease:+more+or+less.">High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less.</a> Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).</li><li>Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+accumbens+shell+attenuates+cue-induced+reinstatement+of+both+cocaine+and+sucrose+seeking+in+rats.">Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats.</a> Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).</li><li>Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reinstatement+model+of+drug+relapse:+recent+neurobiological+findings,+emerging+research+topics,+and+translational+research.">The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research.</a> Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).</li><li>Grubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropsychological+safety+of+nucleus+accumbens+deep+brain+stimulation+for+major+depression:+effects+of+12-month+stimulation.">Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).</li><li>Lyons, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation:+current+and+future+clinical+applications.">Deep brain stimulation: current and future clinical applications.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).</li><li>McIntyre, C. C., Hahn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+perspectives+on+the+mechanisms+of+deep+brain+stimulation.">Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation.</a> Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).</li><li>Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sing+the+mind+electric+-+principles+of+deep+brain+stimulation.">Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation.</a> European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).</li><li>Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+adult+rodent+hippocampal+neurogenesis+by+deep+brain+stimulation.">The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation.</a> Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).</li><li>Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+changes+in+the+rat+hippocampus+after+deep+brain+stimulation+of+the+anterior+thalamic+nucleus.">Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).</li><li>Hattiangady, B., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+decreased+hippocampal+neurogenesis+in+chronic+temporal+lobe+epilepsy.">Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49, 26-41 (2008).</li><li>Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+temporal+lobe+epilepsy+is+associated+with+severely+declined+dentate+neurogenesis+in+the+adult+hippocampus.">Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).</li><li>Madsen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neurogenesis+in+a+model+of+electroconvulsive+therapy.">Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy.</a> Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).</li><li>Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapidly+acquired+and+persistent+spatial+memory+task+that+induces+immediate+early+gene+expression.">A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression.</a> Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).</li><li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+deficiency+in+postnatal+neural+progenitor+cells+in+the+dentate+gyrus+leads+to+emotional+and+cognitive+impairment.">Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment.</a> The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).</li><li>Alberi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Notch+signaling+in+neurons+requires+Arc/Arg3.1+and+is+essential+for+synaptic+plasticity+in+hippocampal+networks.">Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks.</a> Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).</li><li>Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+step-wise+approach+to+deep+brain+stimulation+in+mice.">A step-wise approach to deep brain stimulation in mice.</a> Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).</li><li>Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+General+method+for+evaluating+deep+brain+stimulation+effects+on+intravenous+methamphetamine+self-administration.">A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).</li><li>Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+guided+implantation+of+electrodes+into+the+subthalamic+nucleus+of+rats+for+long-term+deep+brain+stimulation.">Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).</li><li>McHugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentate+gyrus+NMDA+receptors+mediate+rapid+pattern+separation+in+the+hippocampal+network.">Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network.</a> Science. 317 (5834), 94-99 (2007).</li><li>Gonzalez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+prefrontal+cortex+is+a+crucial+node+of+a+rapid+learning+system+that+retrieves+recent+and+remote+memories.">Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction:+measuring+synapse+size,+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy.">The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).</li><li>Pizzolato, G., Mandat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+for+movement+disorders.">Deep brain stimulation for movement disorders.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).</li><li>Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+recent+trends+and+further+promising+directions+in+functional+neurosurgery.">Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).</li><li>Laxton, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+deep+brain+stimulation+of+memory+circuits+in+Alzheimer's+disease.">A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease.</a> Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).</li><li>Min, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+induces+BOLD+activation+in+motor+and+non-motor+networks:+an+fMRI+comparison+study+of+STN+and+EN/GPi+DBS+in+large+animals.">Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals.</a> NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).</li><li>Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA sequencing and analysis. 2015 (11), 951-969 (2015).</li><li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons:+activity-dependent+promoters+have+come+of+age.">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).</li><li>Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+after+transient+global+ischemia+in+gerbils.">Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils.</a> Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).</li><li>Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat:+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation.">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

A técnica de HF-DBS tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta poderosa para o tratamento de muitos distúrbios neurológicos, desde a década de 1990. Até agora, o trabalho de Marco de HF-DBS é para o tratamento da doença de Parkinson e tremor essencial, que atraiu muita atenção e interesse, tanto na comunidade científica e clínica. Existem vários tipos de estudos em andamento de HF-DBS por muitos grupos para aplicação terapêutica do HF-DBS em certas desordens neurológicas e psiquiátricas<sup class=...

HF-DBS é uma tecnologia neurocirúrgica para estimulação elétrica no cérebro, o que tem sido desenvolvido desde a década de 18701. Na década de 1980, HFS foi usado primeiramente como uma potencial intervenção terapêutica para a doença de Parkinson e distúrbios do movimento outro2. Nas últimas décadas, HF-DBS tem sido mais amplamente utilizada no tratamento de distúrbios cerebrais, que são atualmente incurável por uma estratégia terapêutica tradicional. Particularmente, devido a melhoria na precisão do eléctrodo HFS, resultados altamente eficazes e efeitos colaterais mínimos, o número de distúrbios cerebrais tratados por HF-DBS aumentou significativamente nas últimas décadas3,4, 5. Por exemplo, HF-DBS foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da doença de Parkinson (PD), demência do tipo Alzheimer, tremor essencial e outros tipos de movimento transtornos2,6, 7. em pacientes com DP, o medicamento dopaminérgico é reduzido até 50% durante HF-DBS8. Além do sucesso do tratamento dos distúrbios do movimento, HF-DBS também demonstrou seus poderosos efeitos no tratamento de doenças psiquiátricas na clínica e para o aumento do cognitivo como bem2,9, 10 , 11. Note-se que a pesquisa de HFS para o tratamento de outros transtornos psiquiátricos estão em vários estágios, oferecendo muita promessa para pacientes12.
Embora muitos estudos têm demonstrado que um focal HFS tem efeitos locais e remotos em todo o cérebro13, os mecanismos neurológicos e moleculares dos efeitos permanecem indescritível2,14. Na clínica, terapêutica HF-DBS geralmente é aplicado de forma a longo prazo para o tratamento da doença de Parkinson e dor crônica, etc. , que muitas opiniões são levantadas para explicar a melhoria gerada por um tratamento de HF-DBS, entre os qual uma possibilidade que a corrente HFS modula a actividade de rede neuronal, provavelmente por uma despolarização repetitiva de axônios nas proximidades do eletrodo implantado de HFS. Ou, HF-DBS pode alterar a taxa de descarga dos neurônios de saída e as metas projetadas. Também, HF-DBS pode levar a alterações sinápticas a longo prazo, incluindo a potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração (LTD), que podem contribuir para uma melhora sintomática. Até agora, ainda não está claro se o HFS inﬂuences os principais eventos moleculares que regulam o celular processa tais como neurogénese adulta em vivo. Várias linhas de estudos têm demonstrado que o HFS em roedores poderia imitar respostas neurais semelhantes de clinicamente aplicada DBS15,16. Para entender os mecanismos celulares subjacentes de HF-DBS, neste estudo, primeiro montamos um na vivo metodologia HFS em ratos em uma aguda (um dia) ou a forma crônica (cinco dias). Em segundo lugar, montamos uma metodologia de análise por ativação para determinar a alteração da atividade neuronal e neurogênese após uma entrega de HF-DBS.
Dado que a produção neuronal de células-tronco neurais é abundante durante o desenvolvimento embrionário, mas continua ao longo da vida adulta, a zona subgranular hippocampal é uma das principais áreas onde ocorre a neurogênese. O processo de neurogênese é influenciado por vários factores fisiológicos e patológicos. Em certos casos de epilepsia, a neurogênese do hipocampo é drasticamente diminuída17,18. Além disso, uma única eletroconvulsoterapia poderia aumentar significativamente a produção neuronal no giro denteado19. Estas observações sugerem que a atividade eletrofisiológica desempenha um papel crítico na regulação da neurogénese adulta e plasticidade sináptica no hipocampo neurônios. Portanto, para demonstrar ainda mais os efeitos de HF-DBS na atividade neuronal e neurogênese, primeiro realizamos um ensaio de imunocoloração do imediato início gene (IEG) c-fos que é um conhecido marcador de atividade neuronal a curto prazo resultantes da experiência de20. Sinalização de Notch1 é detectado também para monitorar a sinalização ativação após a entrega HFS21,22. Além disso, podemos também detectar a produção neuronal por um BrdU rotulagem análise após a indução de HF-DBS em várias maneiras, embora BrdU coloração também pode ser um marcador para gliogenesis.
No presente estudo, duas metodologias HFS são adaptadas para a ativação da DG hippocampal de destino diretamente e indiretamente. O eletrodo é implantado para a DG diretamente ou implantou no caminho de perforant medial (PP), que envia projeções para ativar os neurônios da DG. Para a indução de HF-DBS, um estimulador programável é apresentado para uma estimulação contínua através do eletrodo fixo sobre a cabeça de rato. Para determinar os efeitos de HFS na ativação neuronal e neurogênese, detectamos a expressão de c-fos e Notch1 por coloração imunofluorescente e o número de neurônios positivos BrdU-incorporada na região DG hippocampal, respectivamente, após a o tratamento de HFS. Particularmente, os efeitos sobre a neurogênese na DG o HF-DBS são comparados entre aguda e uma forma de estimulação crônica, ou entre uma direta e uma forma de estimulação indireta, respectivamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:975px;" width="975">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:255px;">Brain stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:215px;">Stoelting</td>
			<td style="width:199px;">51730D</td>
			<td style="width:307px;">Stereotactic intracranial implantation for mouse</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:255px;">Stimulator</td>
			<td style="width:215px;">A-M systems</td>
			<td style="width:199px;">Model 3800</td>
			<td>MultiStim 8-Channel programmable stimulator</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:255px;">Dental driller</td>
			<td style="width:215px;">Saeshin Precision Co., Ltd</td>
			<td style="width:199px;">STRONG 90</td>
			<td>For drilling and crainiotomy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:255px;">Burr</td>
			<td style="width:215px;">Meisinger</td>
			<td style="width:199px;">HM1 005#</td>
			<td>For drilling and crainiotomy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:255px;">Digidata 1550 Digitizer</td>
			<td style="width:215px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:199px;">AXON 1550</td>
			<td>High-resolution data acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Cryotome</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Cryotome FSE</td>
			<td>Cutting frozen sections of specimens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:215px;">Olympus</td>
			<td style="width:199px;">FV-1200</td>
			<td>Japan, with 20x Objective (NA 0.45)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:255px;">Mouse surgery tools</td>
			<td style="width:215px;">F.S.T.</td>
			<td style="width:199px;">14084-08,11254-20,16109-14</td>
			<td style="width:307px;">Scissors, forceps, bone cutter, holders etc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:215px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:199px;">4579</td>
			<td>20-50mg/kg for i.p. injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Penicillin G&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">P3032</td>
			<td>75,000 U for i.m. injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Carprofen</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:199px;">SML1713</td>
			<td>5-10mg/kg, for s.c. injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:215px;">Beijing Solarbio Sci-Tech Co.&#160;</td>
			<td style="width:199px;">P1110</td>
			<td>stocking solution for tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate buffer (PBS)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:199px;">10010023</td>
			<td>pH7.4, 500ml in stocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:215px;">Sakura</td>
			<td style="width:199px;">4583</td>
			<td>Formulation of water-soluble glycols and resins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">anti-BrdU antibody</td>
			<td style="width:215px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab6326</td>
			<td>Dilutions:1/800</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">anti-c-fos antibody</td>
			<td style="width:215px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab209794</td>
			<td>Dilutions:1/500</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:255px;">Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568)</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:199px;">A11036</td>
			<td>Dilutions:1/500</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:215px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:199px;">712-546-150</td>
			<td>Dilutions:1/500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:255px;">Antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:215px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:199px;">H-1200</td>
			<td>Counterstaining with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">anti-Notch1 antibody (C-20)</td>
			<td style="width:215px;">Santa Cruz Biotech</td>
			<td style="width:199px;">sc-6014</td>
			<td>Dilutions:1/50</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:255px;">Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488)</td>
			<td style="width:215px;">Abcam</td>
			<td style="width:199px;">ab150073</td>
			<td>Dilutions:1/1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an invasive method for the activation of the mouse dentate gyrus by high-frequency stimulation

Estimulação elétrica de alta frequência (HFS), utilizando eletrodos implantados visando diversas regiões do cérebro, tem sido comprovada como tratamento eficaz para várias desordens neurológicas e psiquiátricas. HFS na região profunda do cérebro, também chamado de estimulação profunda do cérebro (DBS), está se tornando cada vez mais importante em ensaios clínicos. Recentes progressos no campo da cirurgia de alta frequência (HF-DBS) de DBS começou a espalhar a possibilidade de utilizar esta técnica invasiva para outras situações, como tratamento para o transtorno de depressão maior (MDD), transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) e assim no.
Apesar destas indicações em expansão, os mecanismos subjacentes dos efeitos benéficos do HF-DBS permanecem enigmáticos. Para resolver esta questão, uma abordagem é usar eletrodos implantados que ativam escassamente distribuídas subpopulações de neurônios por HFS. Tem sido relatado que HFS no núcleo anterior do tálamo poderia ser usado para o tratamento da epilepsia refratária na clínica. Os mecanismos subjacentes podem estar relacionados com a neurogênese aumentada e alteraram a atividade neuronal. Portanto, estamos interessados em explorar as alterações fisiológicas de detecção de atividade neuronal, bem como a neurogênese no giro denteado do rato (DG) antes e após o tratamento de HFS.
Este manuscrito, descrevemos as metodologias para HFS direcionar a ativação da DG em camundongos, diretamente ou indiretamente e de forma aguda ou crônica. Além disso, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de fatias de cérebro para c-fos e Notch1 imunofluorescência coloração para monitorar a atividade neuronal e ativação de sinalização e para bromodeoxyuridine (BrdU) rotulagem para determinar o neurogênese após a indução de HF-DBS. A ativação da atividade neuronal e neurogênese após o tratamento de HF-DBS fornece evidência direta Neurobiológica e potenciais benefícios terapêuticos. Particularmente, esta metodologia pode ser modificada e aplicada para atingir outras regiões do cérebro interessados como os gânglios basais e regiões subtalâmica para distúrbios cerebrais específicas na clínica.

Após a estimulação de HF-DBS para a sub-região DG hippocampal diretamente ou a sub-região PP para ativar o DG indiretamente através de inseridos eletrodos usando os ajustes estereotáxico, os roedores foram anestesiados com pentobarbital e amostragem 3h após a estimulação de HF-DBS ontem para o c-fos e Notch1 immunostaining. Para a coloração de BrdU, 36 h após a última injecção de BrdU após 1 dia ou 5 dias de estimulação de HF-DBS, os roedores foram ane...

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An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Este protocolo mostra como configurar um método confiável de HFS em camundongos. Neurônios em todo giro denteado do hipocampo são estimulados eletricamente por HFS diretamente e indiretamente em vivo. Atividade neuronal e sinalização molecular são examinados por c-fos e coloração imunofluorescente Notch1, respectivamente; neurogênese é quantificada pela bromodeoxyuridine para ensaio de rotulagem.

Um método invasivo para a ativação do giro denteado do Mouse pela estimulação de alta frequência

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

an-invasive-method-for-activation-mouse-dentate-gyrus-high-frequency

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.6K visualizações.  Beijing Institute of Basic Medical Sciences. Este protocolo mostra como configurar um método confiável de HFS em camundongos. Neurônios em todo giro denteado do hipocampo são estimulados eletricamente por HFS diretamente e indiretamente em vivo. Atividade neuronal e sinalização molecular são examinados por c-fos e coloração imunofluorescente Notch1, respectivamente; neurogênese é quantificada pela bromodeoxyuridine para ensaio de rotulagem.

Vídeo: An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Usando o protocolo Theta-Burst para Explorar Mechasnism de Plasticidade em Indivíduos com Síndrome do X Frágil e Autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Neurociência

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

O dispositivo NeuroStar TMS: Conduzindo a FDA Aprovado protocolo para o tratamento da depressão

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Parênquima não-invasivo, Vascular e Metabólica alta freqüência ultra-som e Fotoacústica Rat Cerebral Profunda Imagem

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A protocol is provided to generate a model for studying CA1 &#947; oscillations (20 - 80 Hz). These &#947; oscillations are stable for at least 30 min&#160;and depend upon excitatory and inhibitory synaptic activity in addition to activation of pacemaker currents. Tetanically stimulated oscillations have a number of reproducible and easily quantifiable characteristics including spike count, oscillation duration, latency and frequency that report upon the network state. The advantages of the electrically stimulated oscillations include stability, reproducibility and episodic acquisition enabling robust characterization of network function. This model of CA1 &#947; oscillations can be used to study cellular mechanisms and to systematically investigate how neuronal network activity is altered in disease and by drugs. Disease state pharmacology can be readily incorporated by the use of brain slices from genetically modified or interventional animal models to enable selection of drugs that specifically target disease mechanisms.

Oscillations are fundamental network properties and are modulated by disease and drugs. Studying brain-slice oscillations allows characterization of isolated networks under controlled conditions. Protocols are provided for the preparation of acute brain slices for evoking CA1 &#947; oscillations.

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Efeitos da estimulação da corrente alternada transcraniana no córtex Motor primário por on-line abordagem combinada com estimulação magnética transcraniana

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition follows a combinatorial coding scheme, where one OR can be activated by a set of odorants and one odorant can activate a combination of ORs. Through such combinatorial coding, organisms can detect and discriminate between a myriad of volatile odor molecules. Thus, an odor at a given concentration can be described by an activation pattern of ORs, which is specific to each odor. In that sense, cracking the mechanisms that the brain uses to perceive odor requires the understanding odorant-OR interactions. This is why the olfaction community is committed to &#34;de-orphanize&#34;&#160;these receptors. Conventional in vitro systems used to identify odorant-OR interactions have utilized incubating cell media with odorant, which is distinct from the natural detection of odors via vapor odorants dissolution into nasal mucosa before interacting with ORs. Here, we describe a new method that allows for real-time monitoring of OR activation via vapor-phase odorants. Our method relies on measuring cAMP release by luminescence using the Glosensor assay. It bridges current gaps between in vivo and in vitro approaches and provides a basis for a biomimetic volatile chemical sensor.

Physiologically, odorant receptors are activated by odorant molecules inhaled in the vapor phase. However, most in vitro systems utilize liquid phase odorant stimulation. Here, we present a method that allows real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation upon odorant stimulation in vapor phase.

Em tempo real em Vitro monitoramento da ativação do Odorant Receptor por um odorante na fase de Vapor

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Estabelecimento de Infarto Agudo de Pontina em Ratos por Estimulação Elétrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...