Este projecto foi financiado pela Universidade Norueguesa de Ciências da vida e o Conselho de pesquisa da Noruega, número de concessão, 243811 e 244461 (programa de aquicultura). Estamos gratos à Lourdes Carreon Tan na Universidade Norueguesa de Ciências da vida para manter as instalações de peixe.

As experiências com animais realizadas neste estudo foram aprovadas pela Universidade Norueguesa de Ciências da vida, seguir as orientações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa.
1. preparação de soluções
<ol><li>Calibre os instrumentos de medidor de aparelhos e pH de acordo com as instruções do fabricante para garantir uma medição correta.</li>
	<li>
Preparar 500 mL de Ca2 +- e Mg2 +-livre fosfato salino de Dulbecco (dPBS), ajustar o pH a 7.75 (etapa 1.2.1) e a pressão osmótica para 290 mOsm/kg (etapa 1.2.2) antes de uma filtração estéril (etapa 1.2.3).
	<ol>
<li>Ajuste o pH a 7.75 com um medidor de pH calibrado cuidadosamente adicionando gotas de uma solução de NaOH 1 M, agitando cuidadosamente a solução.</li>
		<li>Medir a osmolalidade da solução usando um aparelhos calibrados e calcular a quantidade de manitol, necessário para aumentar a pressão osmótica para 290 mOsm/kg. Adicione a quantidade necessária de manitol e em seguida medir a osmolalidade da solução novamente para garantir o ajuste correto. Nota: A quantidade de manitol necessário depende a osmolalidade medida, que normalmente varia entre diferentes lotes. Uma molécula de manitol é igual a 1 partícula osmótica.</li>
		<li>Estéril-filtrar a solução de dPBS usando um filtro de 0,2 µm. Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C pelo menos 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 500 mL de meio de cultura Leibovitz (L-15) sem L-glutamina e bicarbonato e complementar com 10mm NaHCO3 (passo 1.3.1), glicose de 4,5 mM (etapa 1.3.2) e glutamina comercialmente disponível de 2 mM (etapa 1.3.3). Ajustar a solução para 290 mOsm/kg (etapa 1.3.4), filtro estéril (passo 1.3.5) e adicionar 2,5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina (etapa 1.3.6). Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C pelo menos 4 semanas.<ol>
<li>Adicione 420 mg de NaHCO3 por 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 10 mM.</li>
		<li>Adicione 405 mg de glucose por 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 4,5 mM.</li>
		<li>Adicione 5 mL de 100 ações de x de uma solução de glutamina em 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 2 mM. Mexa até que todos os solutos são dissolvidos.</li>
		<li>Ajuste a solução para 290 mOsm/kg com manitol usando um aparelhos (como o realizado na etapa 1.2.2).</li>
		<li>Realize uma filtração estéril do meio de L-15 usando um filtro de 0,2 µm.</li>
		<li>Após a filtração estéril, adicione 2,5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina, correspondente a 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 50 mL de uma solução de tripsina usando 1 mg/mL (0,1%) tipo de tripsina QUE II-S dissolvido na dPBS modificados (preparado na etapa 1.2). Faça alíquotas de 2 mL em tubos de plástico estéril e armazená-los a-20 º C até o uso. Nota: Alíquotas de 2 mL podem ser armazenadas a-20 º C pelo menos 3 meses.</li>
	<li>Prepare-se 50 mL de uma solução de inibidor de tripsina usando 1 mg/mL de (0,1%) tripsina inibidor tipo S e completá-lo com 2 µ g/mL de DNase eu dissolvido na dPBS modificados (preparado na etapa 1.2). Faça alíquotas de 2 mL em tubos de plástico estéril e armazená-los a-20 º C até o uso. Nota: Alíquotas de 2 mL podem ser armazenadas a-20 º C pelo menos 3 meses.</li>
</ol>2. preparação do equipamento
<ol><li>Prepare-se pipetas de vidro pelo fogo da ponta para a dissociação de célula de polimento. Fazer dicas com 2 categorias de tamanho diferentes (uma abertura média de 0,6-0,8 µm e uma pequena abertura de 0,4 – 0,6 µm), jogando com o tempo e a distância entre a chama rodando simultaneamente a pipeta. Coloque as pipetas de vidro em um recipiente de vidro limpo e autoclave-los (usando o modo sólido a 105 ° C por 45 min).</li>
	<li>Prepare uma caixa de isopor com gelo.</li>
	<li>Prepare um tubo de plástico com 1,5 mL de dPBS modificados (preparado na etapa 1.2) para transferir os pituitaries para durante a dissecção e mantê-lo no gelo.</li>
	<li>Prepare um tubo de 15 mL com 10 mL de dPBS modificados (preparado na etapa 1.2) e mantê-lo no gelo até a dissociação de célula.</li>
	<li>Prepare fresco ou descongelar alíquotas das soluções de inibidor de tripsina (preparadas em etapas 1.4 e 1.5) e tripsina e mantê-los no gelo até o uso.</li>
	<li>Configure o banho de água a 26 ° C antes de iniciar a dissecação para permitir que a água atingir a temperatura desejada antes a dissociação química dos pituitaries.</li>
	<li>Limpe todas as ferramentas de dissecação com etanol a 70% antes, durante e após o uso, incluindo a pinça fina para usar para a dissecção e agulhas finas e uma placa de cera para fixar os peixes. Usar luvas limpas (alterar e limpar frequentemente) durante todo o procedimento para evitar uma potencial contaminação das células.</li>
</ol>3. na hipófise dissecção e dissociação de célula
<ol><li>Eutanásia o peixe por imersão em lama de gelo (0 ° C). Deixe o peixe da lama de gelo pelo menos 1 min garantir um choque hipotérmico irreversível. Nota: Perda de imobilização e equilíbrio ocorrerá após alguns segundos. Verifique se o peixe está completamente submersa na água gelo e não reside em cima do gelo, como o último conduzirá à asfixia e potencial pele queima em vez de um choque hipotérmico rápido e humano.</li>
	<li>Rapidamente o peixe em uma rede de transferência para uma placa de cera sob o microscópio de dissecação e destruir a coluna por um soco de agulha no pescoço.</li>
	<li>Pino da cabeça do peixe para a placa de cera usando agulhas finas, inserindo uma agulha na parte dianteira (sobre a boca) e um em cada lado da cabeça (atrás do cérebro) para estabilizar a cabeça perante a dissecação.</li>
	<li>Ver o peixe sob o microscópio de dissecação e delicadamente, raspe as escamas na parte superior da cabeça usando a pinça fina com uma ponta em ângulo.</li>
	<li>Cuidadosamente Introduza a ponta angular da pinça fina sob a pele do lado da cabeça e remover o teto do crânio, movendo lentamente a pinça na direção da boca, mantendo um aperto firme para a pinça encerram o teto do crânio.</li>
	<li>Corte a medula espinhal completamente usando a pinça com ponta em ângulo. Nota: O tempo é um fator importante, para trabalhar eficientemente e com precisão limitar o tempo gasto desde a dissecação dos pituitaries até que as células são banhadas no prato. Depois de alguma prática, dissecação da hipófise deve levar em torno de 2 – 3 min por peixe, dos quais apenas cerca de 10 s são necessários para atender a hipófise quando o cérebro já está exposto.</li>
	<li>Vire cuidadosamente o cérebro em direção a boca para expor a hipófise e dissecá-lo com uma pinça limpa com uma ponta reta. Transferir a pituitária para um tubo de plástico contendo 1,5 mL modificado dPBS (para obter detalhes, consulte Passo 2.3) colocado no gelo. Verifique se a ponta da pinça sob o microscópio para garantir que a hipófise com êxito é adicionada ao tubo e nada é deixado a fórceps. Nota: Disse como muitos pituitaries conforme necessário, dependendo do número de pratos de cultura que vão ser preparados simultaneamente. Como regra geral, calcule pelo menos 10 pituitaries de peixe adulto por prato para ter uma densidade adequada de células (que depende da aplicação a jusante).</li>
	<li>Spin para baixo as pituitaries em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente. Retire o dPBS usando uma pipeta de vidro cuidadosamente e tome cuidado para evitar a remoção de qualquer pituitaries.</li>
	<li>Adicione 1 mL da solução de tripsina (preparada na etapa 1.4) para lavar as pituitaries, girá-los para baixo em uma centrífuga de mesa para 1-2 s e remover a maior parte do líquido usando uma pipeta de vidro antes de adicionar um adicional 1 mL de solução de tripsina.</li>
	<li>Incubar o tubo em um banho de água a 26 ° C durante 30 minutos, de preferência com agitação suave, ou alternativamente, agite o tubo algumas vezes durante o período de incubação.</li>
	<li>Spin para baixo as pituitaries em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e certifique-se de todos os pituitaries estão localizados na parte inferior do tubo. Remover a maior parte da solução de tripsina com uma pipeta de vidro e adicione 1 mL da solução de inibidor de tripsina (preparada na etapa 1.5) para inactivar a tripsina e lavar os pituitaries.</li>
	<li>Recolha os pituitaries na parte inferior do tubo girando-os para baixo em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente. Remover a maior parte do líquido com uma pipeta de vidro e adicione 1 mL da solução de inibidor de tripsina (preparada na etapa 1.5). Colocar o tubo em um banho de água a 26 ° C durante 20 minutos, de preferência com agitação suave, ou alternativamente, agite o tubo algumas vezes durante o período de incubação para inactivar a tripsina.</li>
	<li>Prepare um prato de cultura de célula poli-d-lisina-revestido de 35 milímetros com um fundo de vidro central adicionando 2 mL do meio de L-15 e deixar que incube durante pelo menos 10 min a 26 ° C e com 1% de CO2 para que conseguir atingir a temperatura e o pH antes de chapear as pilhas. Nota: Também pode ser usada numa placa de cultura de células de plástico. A principal vantagem de usar um prato com um fundo de vidro centralizado é que a área onde as células são banhadas é menor, e portanto, menos células da hipófise são necessárias por prato. Algumas aplicações a jusante também podem requerer um fundo de vidro (ou seja, algumas técnicas de imagem).</li>
	<li>Defina a refrigeração centrífuga para tubos de 15 mL a 4 ° C, para permitir-lhe chegar à temperatura desejada antes de iniciar a dissociação mecânica.</li>
	<li>Recolher os pituitaries na parte inferior do tubo por girando para baixo o tubo com a solução de inibidor de tripsina (da etapa 3.11) em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e certifique-se de todos os pituitaries estão localizados na parte inferior do tubo antes cuidadosamente remover a maior parte da solução do inibidor de tripsina utilizando uma pipeta de vidro. Nota: Execute todas as etapas seguintes do protocolo em uma bancada de fluxo laminar (LAF) certificadas pelo trabalho de célula evitar uma contaminação das células.</li>
	<li>Adicione 1 mL de gelado dPBS modificados (preparado na etapa 2.4) para as peças de tecido na hipófise e chupar delicadamente os pedaços de tecido e descer (6 – 7. x) em uma pipeta de vidro polido fogo (preparada no passo 2.1). Nota: A temperatura é um aspecto essencial, portanto, mantenha todas as soluções a 4 ° C. Deste ponto em diante, execute todas as etapas no gelo quando possível.</li>
	<li>Gire para baixo as peças de tecido em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e transferir cuidadosamente a parte superior do dPBS contendo as células dissociadas (quase 1 mL) para um novo tubo de 15 mL colocado no gelo. Evite se mover da pipeta para o fundo do tubo, onde ficam as peças de tecido.</li>
	<li>Repita a etapa 3.16 – 3.17, dissociando as células em 1 mL de dPBS gelada de cada vez, até que todos os 10 mL de dPBS é usado. Comece usando uma pipeta de vidro com uma abertura de tamanho médio e alternar para uma pipeta de vidro com uma abertura menor no final (para os último 3 – 4 mL de dPBS adicionado) da dissociação. Se há pedaços de tecido ainda visível no final do processo de dissociação, aumentar a pipetagem de aproximadamente 10 x para as 2 últimas etapas de dPBS para dissociação e finalmente deixar os pedaços de tecido residual. Ressuspender as células suavemente e evitar a criação de bolhas como pode causar danos nas células quando as células anexa à superfície das bolhas. Nota: Esta é uma etapa crítica do presente protocolo e requer algum treinamento para obter um bom resultado.</li>
	<li>Equilibrar o tubo no centrifugador (pre-resfriado a 4 ° C) e spin-down as células a 200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Certifique-se de marcar a lateral do tubo onde será o centrifugado.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o tubo de centrífuga e suavemente, transferir o sobrenadante com uma pipeta de vidro para um tubo de plástico vazia 15 mL diretamente após a centrifugação. Não se esqueça de remover a maior parte do sobrenadante, mas tome cuidado para não perder o pequeno centrifugado (muitas vezes invisíveis).</li>
	<li>Cuidadosamente Ressuspender as células em 50 a 100 µ l de meio de cultura de L-15. Nota: Neste passo, é possível contar as células e/ou executar um teste de viabilidade (como uma célula de contagem na presença de azul de trypan usando um hemocytometer), mas cuidado que utilizando parte da suspensão de células para o efeito irá diminuir o rendimento. Evite usar um volume grande de suspensão como aumentará o risco de células difusão fora do centro do prato.</li>
	<li>Escorrer cuidadosamente as células dissociadas no meio do prato de cultura de células contendo 2 mL do meio de L-15 (preparado na etapa 3.13). Permitir que as células para afundar até o fundo do prato por aproximadamente 5 min antes de movê-los para a incubadora, para evitar que as células espalhar fora da parte submersa da parte inferior de vidro.</li>
	<li>Incube o prato no 26 ° C e 1% CO2 para permitir que todas as células afundar completamente e anexar para o fundo do prato.</li>
	<li>Depois de 30 min, olhe para as células no microscópio para certificar-se de que eles têm ligado para o prato de cultura.</li>
	<li>Continue a incubar as células a 26 ° C e 1% de CO2.</li>
	<li>Cuidadosamente, mudar da maioria (mas não todos) o médio a cada 3-4 dias. Nota: Evite alterar o meio mais frequentemente, que possa perturbar as células e fazê-los desanexar da parte inferior do vidro. Use as células para experiências dentro de uma semana após a semeadura-los.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Ribeiro, L. 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Os autores não têm nada a declarar.

Sistemas de cultura in vitro células fornecem ferramentas poderosas para os investigadores responder a uma infinidade de questões biológicas diferentes se usado no caminho certo1. É importante lembrar que células dissociadas que perderam suas conexões com as células vizinhas ter obtido diferentes propriedades funcionais do que tinham originalmente em vivo. Para evitar ser correndo o risco de má interpretação dos resultados obtidos em experimentos em vitro , é ...

Cultura de pilha é uma das principais ferramentas usadas em pesquisa biológica molecular, proporcionando um excelente modelo sistema para responder perguntas biológicas diferentes, variando de fisiologia celular normal a droga triagem e carcinogênese1. As células primárias, isoladas diretamente do tecido animal usando métodos enzimáticos e/ou mecânicos, são muitas vezes consideradas biologicamente mais relevantes do que linhas celulares como a resposta biológica pode estar mais perto a situação na vivo . Protocolos para a preparação de culturas de células primárias devem ser otimizados para cada tipo de espécie e célula de interesse, a fim de imitar as características para que uma célula é adaptada e obter resultados significativos fisiologicamente.
Inúmeros protocolos descrevem as condições de cultura para sistemas de células de mamíferos, enquanto protocolos semelhantes descrevendo as condições de cultura primária de células de peixes são bastante escassos em comparação. As células são vulneráveis a mudanças rápidas de temperatura, pH e pressão osmótica e são particularmente frágeis durante o procedimento de dissociação. Soluções de sal comerciais e meios de cultura utilizados para culturas de células de mamíferos não são ideais para peixes teleósteos, especialmente em termos de sistema (s) tampão de pH e pressão osmótica. É, portanto, importante medir e ajustar as soluções aos níveis fisiologicamente relevantes desses parâmetros na espécie de interesse.
Foram feitas culturas primárias da hipófise de várias espécies de peixes teleósteos, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio)2,3, capim (Ctenopharyngodon idella)4, peixe dourado (Carassius auratus deda carpa )5, truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)6, enguia europeia (Anguilla anguilla)7, tilápia (Oreochromis mossambicus)8, peixe-zebra (Danio rerio)9, e Bacalhau do Atlântico (Gadus morhua)10. Para ajustar a temperatura de incubação para as espécies de interesse, além de vários desses protocolos têm incubadas as células em condições semelhantes a mamíferos que podem ser ideais para as espécies de interesse, com um pH de 7.2 a 7.5 em um ambiente umidificado contendo 3-5% de CO2. Além disso, é claro se a pressão osmótica de soluções utilizadas para a preparação de várias destas culturas de célula primária foram ajustada e estável entre diferentes soluções.
O protocolo atual é baseado no trabalho anterior com culturas primárias do bacalhau do Atlântico10 e inclui ajustes de temperatura de incubação, osmolaridade, pH e sistemas-tampão pH, incluindo a pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2), para a fisiologia do medaka (o. latipes). Medaka é um peixe de água doce pequeno (3 – 4 cm), nativo do sudeste da Ásia. Hoje em dia, é usado como uma espécie de modelo em muitos laboratórios de pesquisa ao redor do mundo, como é relativamente fácil para procriar e altamente resistente a muitos peixes comuns doenças11. Existem várias vantagens de usar o medaka como um modelo, incluindo uma tolerância de temperatura de 4 – 40 ° C11, um tempo de geração curto, embriões transparentes, um sexo-determinando gene12e um genoma sequenciado13, bem como muitos outros recursos genéticos disponíveis.
As condições de cultura primária neste protocolo são otimizadas para coincidir com a temperatura de 26 ° C que medakas são mantidos na instalação de peixe. Além disso, a osmolalidade é reduzida de 320 mOsm/kg de bacalhau do Atlântico vivem em água salgada para 290 mOsm/kg para medaka vivem em água doce e de acordo com a osmolalidade normal de medaka plasma14. Em comparação, a osmolalidade típica dos mamíferos plasma está na faixa de 275-295 mOsm15. Vive em uma variedade de temperaturas e possuem brânquias que estão em contacto directo com a água, tornando a capacidade de buffer e o pH do sangue e fluido extracelular em peixes diferentes em mamíferos. Meios de cultura mamíferos geralmente incluem sistemas tampão que resultam em um pH de cerca de 7,4 quando a mídia está equilibrada para uma atmosfera padrão de 5% de CO2 no ar umidificado a 37 ° C. O pH é dependente de temperatura e o valor de pH neutro (em água) aumenta com uma diminuição de temperatura16. Típico de peixes teleósteos plasma pH varia de 7,7 a 7,917. A otimização do presente protocolo incluíram uma redução de pH 7,85 bacalhau mantida a 12 ° C pH 7.75 para medaka mantida a 26 ° C, aumentando o CO2 de 0,5% a 1%.
Além disso, a capacidade de tampão bicarbonato é bastante diferente em peixes e mamíferos. CO2 é facilmente trocado sobre as brânquias em peixes e o pCO2 na água é apenas uma pequena fração da pCO2 no pulmão18. Alterar a temperatura ou o pCO2 alterará o pH e o tampão do meio. Consequentemente, o pH, nem o pCO2 recomendado pela incubação de células de mamíferos é ideal para células de peixe e, portanto, os meios de cultura devem ser otimizados com sistemas tampão contendo valores fisiologicamente relevantes para os peixes e os determinada espécie de interesse. Este protocolo descreve como preparar culturas de células primárias de pituitaries medaka e incluem ajustes de pH, osmolaridade, pH e temperatura reserva do sistema de incubação, além de outros parâmetros importantes a considerar ao preparar a célula primária culturas de espécies não-mamíferos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>L5520</td>
			<td>Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &#181;m PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5761</td>
			<td>10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>63565</td>
			<td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>G5400</td>
			<td>4.5 mM&#160; D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 &#181;g/ml Streptomycin).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin type II-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T7409</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 &#181;g/ml Dnase I (see details below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY)</td>
			<td>431097</td>
			<td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-10-C</td>
			<td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Straigt tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Angled 45&#176; tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>Use for dissection of pituitaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alegra X-22R Centrufuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td>
			<td></td>
			<td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Techne (Staffordshire, UK)</td>
			<td></td>
			<td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipettes</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>612-1701</td>
			<td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>521-2844</td>
			<td>Any small table centrigue will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine needles / insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>26001-40</td>
			<td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Cultura de pilha primária é uma poderosa ferramenta comumente usada pelos cientistas para estudar as propriedades celulares e mecanismos de células isoladas em um ambiente controlado. Apesar das vastas diferenças na fisiologia entre mamíferos e peixes, protocolos de cultura de célula primária de peixe são frequentemente com base em condições de cultura mamíferos, frequentemente com apenas pequenas modificações. As diferenças ambientais afetam não só a temperatura do corpo, mas também soro sanguíneo parâmetros tais como a osmolaridade, pH e capacidade tampão de pH. Como meios de cultura celular e soluções de trabalho semelhantes são feitas para imitar as características do líquido extracelular e/ou soro de sangue para que uma célula é adaptada, é fundamental que esses parâmetros são ajustados especificamente para o animal em questão.
O atual protocolo descreve as condições de cultura primária otimizado para medaka (Oryzias latipes). O protocolo fornece etapas detalhadas sobre como isolar e manter saudável dissociado células da hipófise para mais de uma semana e inclui as seguintes etapas: 1. a adaptação da osmolalidade para os valores encontrados no plasma de sangue medaka, 2. a adaptação do temperatura de incubação à temperatura normal medaka (aqui na instalação de aquário) e 3. o ajuste do pH e bicarbonato buffer para valores comparáveis a outras espécies de peixes vivem em temperaturas semelhantes. Os resultados apresentados usando o protocolo descrito promovem resultados fisiologicamente significativos para medaka e podem ser usados como um guia de referência pelos cientistas fazer culturas de células primárias de outras espécies não-mamíferos.

Este protocolo descreve a preparação de uma cultura de célula primária de pituitaries medaka e fornece as células saudáveis que podem ser mantidas em uma cultura pelo menos uma semana. O protocolo é baseado em valores correspondentes fisiológicos medaka14 e além disso é otimizado para o tecido da hipófise em peixes adultos, usando um pH de 7.75 e uma osmolalidade de 290 mOsm/kg durante todo o procedimento desde a colheita de tecidos para o chapeado célu...

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Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Aqui descrevemos um protocolo para preparar e manter as culturas de células da hipófise primário de medaka (Oryzias latipes). As condições otimizadas no presente protocolo considerar parâmetros importantes, tais como temperatura, pH e pressão osmótica imitando as condições fisiológicas dos peixes, possibilitando resultados fisiologicamente mais significativos.

Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

preparation-high-quality-primary-cell-culture-from-fish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K visualizações.  Norwegian University of Life Sciences. Aqui descrevemos um protocolo para preparar e manter as culturas de células da hipófise primário de medaka (Oryzias latipes). As condições otimizadas no presente protocolo considerar parâmetros importantes, tais como temperatura, pH e pressão osmótica imitando as condições fisiológicas dos peixes, possibilitando resultados fisiologicamente mais significativos.

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Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Neurociência

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Aquisição de Vídeo de Alta Qualidade Digital de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvais e adultas Comportamentos de uma perspectiva lateral

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or regions from heterogenous tissues. Captured product can be used in a variety of molecular methods for protein, DNA or RNA isolation. However, preservation of RNA from postmortem human brain tissue is especially challenging. Standard visualization techniques for LCM require histologic or immunohistochemical staining procedures that can further degrade RNA. Therefore, we designed a stainless protocol for visualization in LCM with the intended purpose of preserving RNA integrity in post-mortem human brain tissue. The Purkinje cell of the cerebellum is a good candidate for stainless visualization, due to its size and characteristic location. The cerebellar cortex has distinct layers that differ in cell density, making them a good archetype to identify under high magnification microscopy. Purkinje cells are large neurons situated between the granule cell layer, which is a densely cellular network of small neurons, and the molecular layer, which is sparse in cell bodies. Because of this architecture, the use of stainless visualization is feasible. Other organ or cell systems that mimic this phenotype would also be suitable. The stainless protocol is designed to fix fresh-frozen tissue with ethanol and remove lipids with xylene for improved morphological visualization under high magnification light microscopy. This protocol does not account for other fixation methods and is specifically designed for fresh-frozen tissue samples captured using an ultraviolet (UV)-LCM system. Here, we present a full protocol for sectioning and fixing fresh frozen post-mortem human cerebellar tissue and purification of RNA from Purkinje cells isolated by UV-LCM, while preserving RNA quality for subsequent RNA-sequencing. In our hands, this protocol produces exceptional levels of cellular visualization without the need for staining reagents and yields RNA with high RNA integrity numbers (&#8805;8) as needed for transcriptional profiling experiments.

This protocol uses a stain-free approach to visualize and isolate Purkinje cells in fresh-frozen tissue from human post-mortem cerebellum via laser capture microdissection. The purpose of this protocol is to generate sufficient amounts of high-quality RNA for RNA-sequencing.

Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Cultura de células primárias de neurônios Gabaérgicos ou glutamatérgicos purificados estabelecidos através da triagem de células ativadas por fluorescência

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...