Name: preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

Bu proje, yaşam bilimleri ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numarası 243811 ve 244461 (su ürünleri programı) Norveççe üniversite tarafından finanse edildi. Balık tesisi korumak için Lourdes Carreon Tan yaşam bilimleri Norveççe Üniversitesi için minnettarız.

Bu çalışmada gerçekleştirilen hayvan deneyleri yaşam bilimleri, bakım ve araştırma hayvan refahı için aşağıdaki yönergeleri Norveççe Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması çözümleri
<ol><li>Osmometer ve pH metre aletleri doğru ölçümler emin olmak için üreticinin yönergelerine göre kalibre.</li>
	<li>
Ca2 +- ve Mg2 +500 mL hazırlamak-7,75 (adım 1.2.1) için pH ve 290 mOsm/kg (adım 1.2.2) steril filtrasyon (adım 1.2.3) önce osmolalite ayarlama Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (dPBS), ücretsiz.
	<ol>
<li>PH 7,75 için kalibre edilmiş pH metre ile dikkatli bir şekilde çözüm dikkatle karıştırarak 1 M NaOH çözüm damla ekleyerek ayarlayın.</li>
		<li>Kalibre edilmiş bir osmometer kullanarak çözüm osmolalite ölçmek ve mannitol osmolalite 290 mOsm/kg artırmak için gerekli miktarı hesaplar. Mannitol gerekli miktarda ekleyin ve sonra yeniden doğru uyum sağlamak için çözüm osmolalite ölçmek. Not: Genellikle farklı gruplar arasında değişir osmolalite ölçülen, mannitol gerekli miktarı bağlıdır. Bir molekül mannitol 1 ozmotik parçacık eşittir.</li>
		<li>Steril-filtre 0.2 µm filtre kullanarak dPBS çözüm. Not: Çözüm için en az 3 ay 4 ° C'de depolanmış olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L-glutamin ve bikarbonat olmadan iyi (L-15) kültür ortamının 500 mL hazırlamak ve bununla 10 mM NaHCO3 (adım 1.3.1), 4.5 mM glikoz (adım 1.3.2) ve 2 mM piyasada bulunan glutamin (adım 1.3.3) ekleyin. 290 mOsm/kg (adım 1.3.4), çözüm ayarlamak steril filtre bu (1.3.5. adım) ve 2.5 mL penisilin-streptomisin çözeltisi (adım 1.3.6) ekleyin. Not: Çözüm için en az 4 hafta 4 ° C'de depolanmış olabilir.<ol>
<li>NaHCO bir 10 mM çözümü elde etmek kültür ortamının 500 mL3 420 mg ekleyin.</li>
		<li>405 mg glikoz 4.5 mM çözüm elde etmek için kültür ortamının 500 mL başına ekleyin.</li>
		<li>Bir glutamin çözeltinin 100 x stokunun 5 mL 500 mL 2 mM çözüm elde etmek için kültür ortamının ekleyin. Tüm solutes eriyene kadar karıştırın.</li>
		<li>Çözüm 290 mOsm/kg (1.2.2. adımda yapılır gibi) bir osmometer kullanarak mannitol ile ayarlayın.</li>
		<li>Steril bir filtrasyon 0.2 µm filtre kullanarak L-15 orta gerçekleştirin.</li>
		<li>Steril filtrasyonu sonra 2.5 mL 50 U/mL penisilin ve 50 µg/mL streptomisin için karşılık gelen bir penisilin-streptomisin çözeltisi ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mL 1 mg/mL (% 0,1) tripsin tip II-S (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS içinde çözünmüş kullanarak tripsin çözeltisi hazırlamak. Aliquots 2 ml steril plastik tüplerde yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın. Not: Aliquots 2 ml-20 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir.</li>
	<li>50 mL 1 mg/mL (% 0,1) tripsin inhibitörü türü ben-s kullanarak tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlamak ve 2 µg/mL (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS içinde çözünmüş DNaz ile ek. Aliquots 2 ml steril plastik tüplerde yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın. Not: Aliquots 2 ml-20 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir.</li>
</ol>2. ekipman hazırlanması
<ol><li>Cam pipetler hücre ayrılma için belgili tanımlık uç parlatma yangın hazırlayın. 2 farklı boyutta kategoriler ile keyif yapmak (0,6-0,8 Orta bir açılış µm ve 0.4-0.6 küçük bir açılış µm) oynayarak zaman ve alev olan uzaklığı ile aynı anda pipet dönüm. Cam pipetler bir temiz cam kaba ve Otoklav (katı modu 105 ° C için 45 dk kullanarak) yerleştirin.</li>
	<li>Buz polistren kutusuyla hazırlayın.</li>
	<li>Değiştirilmiş dPBS (1.2 adımda hazırlanan) 1,5 mL plastik bir boru pituitaries için diseksiyon sırasında aktarmak ve buz üzerinde tutmak için hazır olun.</li>
	<li>15 mL tüp 10 mL (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS ile hazırlamak ve hücre ayrılma kadar buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Taze hazırlamak veya aliquots tripsin ve tripsin inhibitörü çözümleri (1.4 ve 1.5 adımlarda hazır) çözülme ve buza kadar kullanmak saklayın.</li>
	<li>Su banyosu 26 ° C-su pituitaries kimyasal ayrışma önce istenilen sıcaklık ulaşmak izin vermek için diseksiyon başlamadan önce ayarlayın.</li>
	<li>Tüm diseksiyon araçları % 70 etanol ile önce sırasında ve sonrasında kullanım, balık yıkmaya diseksiyon ve ince iğneler ve balmumu plaka için kullanılacak iyi forseps dahil olmak üzere temiz. Temiz eldiven kullanın (değiştirmek ve sık sık temiz) hücrelerin bir potansiyel kirlenmesini önlemek için bütün prosedür sırasında.</li>
</ol>3. hipofiz diseksiyon ve hücre ayrılma
<ol><li>Balık Ice slush (0 ° C) çeker tarafından ötenazi. Balık Ice slush geri dönüşü olmayan bir hipotermik şok emin olmak en az 1 dakika bırakın. Not: Bir kaç saniye sonra immobilizasyon ve denge kaybı ortaya çıkar. Balık buzlu suda tamamen sular altında ve buz üstünde tepe-in ikinci boğulma için yol açacak ve potansiyel cilt yerine hızlı ve insancıl hipotermik şok yakar gibi yalan yok emin olun.</li>
	<li>Çabuk, bir balık bir balmumu plakasına diseksiyon mikroskop altında transfer ve boyun ile çelik yerli tarafından omurga yok.</li>
	<li>Bir iğne (ağız) üzerinden açık ve başından (beyin) arkasında her tarafında bir diseksiyon kafasına dengelemeye koyarak ince iğneler, kullanarak balmumu plaka balık başkanı pin.</li>
	<li>Balık diseksiyon mikroskop altında görüntüleyebilir ve yavaşça ölçekler iyi forseps ile açılı bir ipucu kullanarak başın üst kapalı kazımak.</li>
	<li>Dikkatle cilt altında iyi forseps açılı ucu baş taraftan ekleyip yavaşça forseps kafatası çatı kapsayan forseps bir tutuş tutarken agiz cizgisi, yönde hareket ettirerek kafatası çatı kaldırabilirsiniz.</li>
	<li>Omurilik tamamen forseps ile açılı bir ucu kullanarak kesti. Not: Zaman önemli bir faktör, bu yüzden iş verimli ve hücreleri tabakta kaplama kadar doğru bir şekilde pituitaries diseksiyon süreyi sınırlamak için harcanan. Biraz pratik sonra hipofiz diseksiyon yaklaşık 2-3 dk balık, başına sadece 10 etrafında almalısınız s beyin zaten maruz kaldığında hipofiz almaya ihtiyaç vardır.</li>
	<li>Dikkatle beyin hipofiz ortaya çıkarmak ve düz bir ipucu ile temiz forseps ile incelemek için ağız doğru çevirin. Hipofiz değiştirilmiş 1.5 mL dPBS içeren bir plastik tüp transferi (ayrıntılı bilgi için bkz: adım 2.3) buz üzerinde yerleştirilir. Hipofiz başarıyla tüp eklenir ve hiçbir şey üzerinde pensler kaldı emin olmak için mikroskop altında pens ucunu kontrol edin. Not: aynı anda hazırlıklı olmak için gidiyoruz kültür yemekleri sayısına bağlı olarak gerektiğinde çok pituitaries incelemek. Pratik bir kural olarak, yetişkin balık (hangi aşağı akım uygulamaya bağlıdır) uygun bir yoğunluk hücre için çanak başına en az 10 pituitaries hesaplayın.</li>
	<li>Spin aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj pituitaries. Dikkatle cam pipet kullanarak dPBS kaldırmak ve herhangi bir pituitaries kaldırma önlemek için dikkat ediniz.</li>
	<li>Pituitaries yıkama, onları 1-2 s için masa üstü bir santrifüj içinde spin aşağı ve ek 1 mL tripsin çözeltisi eklemeden önce bir cam pipet kullanarak sıvı çoğu kaldırmak için 1 mL (1.4 adımda hazırlanan) tripsin çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Bir su banyosu için tercihen ile nazik sallayarak, 30 dk, 26 ° C'de tüpte kuluçkaya veya alternatif olarak, tüp birkaç kez kuluçka süresi boyunca hafifçe vur.</li>
	<li>Spin aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj pituitaries ve tüm pituitaries tüp alt kısmında yer olduğundan emin olun. Cam Pipet tripsin çözümle çoğunu kaldırın ve tripsin devre dışı bırakın ve pituitaries yıkamak için 1 mL (1.5 adımda hazırlanan) tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Tüpün dibinde pituitaries onları aşağı içinde oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj iplik tarafından toplamak. Cam Pipet ile sıvı çoğu kaldırın ve 1 mL (1.5 adımda hazırlanan) tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin. Bir su banyosu için tercihen nazik sallayarak ile 20 dk, 26 ° C'de tüpü yerleştirin veya alternatif olarak, birkaç kez tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için kuluçka döneminde tüpü hafifçe vur.</li>
	<li>L-15 orta 2 mL ekleyerek ve bunu doğru sıcaklık ve pH hücreleri kaplama önce erişebilmesi için en az 10 dk 26 ° c ve % 1 CO2 kuluçkaya izin Merkez cam alt ile bir 35 mm poli-d-lizin-kaplı hücre kültür yemek hazırlamak. Not: Bir plastik hücre kültür yemek de kullanılabilir. Bir yemek ile merkezi cam alt kullanarak ana avantajı hücreleri nerede kaplama alanı küçükse ve bu nedenle, daha az hipofiz hücreleri çanak gereklidir olmasıdır. Akış aşağı bazı uygulamalar da bir cam alt (yani, bazı görüntüleme teknikleri) gerektirebilir.</li>
	<li>15 mL tüpler için soğutma santrifüj 4 ° C mekanik ayrışma başlamadan önce istenilen sıcaklık ulaşmak izin vermek için ayarlayın.</li>
	<li>Pituitaries iplik metroyla altındaki aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj tripsin inhibitörü çözümde (Kimden adım 3.11) ile tüp ve toplamak tüm pituitaries daha önce tüp dibinde yer olduğundan emin olun dikkatle Cam Pipet kullanarak tripsin inhibitörü çözüm çoğunu kaldırılıyor. Not: hücreleri kirlenmesini önlemek hücre iş için sertifikalı tüm aşağıdaki adımları bir laminar akış Bank (SMD) protokolü uygulayın.</li>
	<li>1 mL (2.4 adımda hazırlanan) buz gibi değiştirilmiş dPBS hipofiz doku parçaları ekleyin ve hafifçe (2.1 adımda hazırlanan) bir Yangın Cilalı Cam Pipet içinde doku parçaları (6-7 x) yukarı ve aşağı emmek. Not: Sıcaklık önemli bir yönü, yani tüm çözümler 4 ° C'de tutmak Bu noktadan itibaren buza mümkün olduğunda tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Spin aşağı doku parçalar halinde oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj ve dikkatle buza yerleştirilen yeni bir 15 mL tüp Disosiye hücreleri (hemen hemen 1 mL) içeren dPBS üst kısmındaki aktarın. Doku parçaları bıraktığı pipet tüp alt doğru hareket kaçının.</li>
	<li>Buz gibi dPBS 1 mL hücrelerde dPBS tüm 10 mL kullanılana kadar teker teker dissociating 3,16-3,17, adımları yineleyin. Bir orta ölçekli açılış ve Cam Pipet sonuna doğru daha küçük bir açılış ile geçiş ile Cam Pipet (son 3-4 mL için eklendi dPBS) ayrılma kullanmaya başlamak. Yapıya ait hala görülebilen doku parçaları ayrılma yordam sonuna doğru iseniz, dPBS ayrılma için 2 son adım doğru yaklaşık 10 x pipetting artırmak ve sonunda kalan doku parçaları geride. Hücreleri nazikçe resuspend ve hücreleri kabarcıkları yüzeye iliştirdiğinizde hücre hasarı neden olabilir gibi kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Not: Bu bir kritik adım bu protokol ve iyi bir sonuç elde etmek için bazı eğitim gerektirir.</li>
	<li>Tüp (4 ° C-önceden soğutmalı) santrifüj ve hücreleri 200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de aşağı spin denge Nerede cep Pelet olacak tüp tarafında işaretlemek emin olun.</li>
	<li>Dikkatle santrifüj tüpü çıkarması ve yavaşça süpernatant cam pipet ile bir boş 15 mL plastik tüp doğrudan Santrifüjü sonra transfer. Çoğu süpernatant kaldırmak ancak küçük (genellikle görünmez) hücre Pelet kaybetmemek için dikkat çekmek emin olun.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde hücre Pelet L-15 kültür orta 50-100 µL içinde resuspend. Not: Bu adımda, bu hücreleri saymak ve/veya bir canlılık testi (örneğin sayım varlığı trypan mavi bir hemasitometre kullanarak bir hücreye) gerçekleştirmek ama bu amaç için hücre süspansiyon parçası kullanarak verimi düşürür dikkat mümkündür. Bu çanak merkezi dışında difüzyon hücreleri riskini artıracaktır gibi bir büyük süspansiyon birim kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Dikkatle Disosiye hücreleri (3.13 adımda hazırlanan) L-15 orta 2 mL içeren hücre kültür çanak ortasında damla. Cam alt batık parçası dışında yayılmış hücreler zorunda kalmamak için kuluçka makinesi, geçmeden önce yemek için yaklaşık 5 dk altına batmaya hücreleri izin.</li>
	<li>Tüm hücreler iyice lavabo ve çanak alt kısmına eklemek izin vermek için 26 ° C ve % 1 CO2 çanak kuluçkaya.</li>
	<li>30 dakika sonra kültür yemek için ekli var emin olmak için mikroskop hücrelerde bakın.</li>
	<li>26 ° C ve % 1 CO2hücreleri kuluçkaya devam'i tıklatın.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde değiştirmek orta her 3-4 günde en çok (ama hepsi değil). Not: Bu hücreleri rahatsız ve onları cam alt kısmından ayırmak gibi orta daha sık değiştirmekten kaçının. Hücreleri deneyler için onları tohum sonra bir hafta içinde kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Ribeiro, L. P., Ahne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cell+culture:+initiation+of+a+line+of+pituitary+cells+from+carp+(Cyprinus+carpio)+to+study+the+release+of+gonadotropin+in+vitro.">Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro.</a> In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).</li><li>Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+pituitary+cells+of+carp+(Cyprinus+carpio)+for+the+study+of+gonadotropin+release.">Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release.</a> In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).</li><li>Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+inhibits+(d-Arg6,+Pro9-NEt)+salmon+gonadotropin-releasing+hormone-+and+dopamine+D1-stimulated+growth+hormone+release+from+perifused+pituitary+cells+of+chinese+grass+carp,+Ctenopharyngodon+idellus.">Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus.</a> General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).</li><li>Chang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+pituitary+cell+dispersion+method+and+primary+culture+system+for+the+studies+of+gonadotropin-releasing+hormone+action+in+the+goldfish,+Carassius+auratus.+I.+Initial+morphological,+static,+and+cell+column+perifusion+studies.">Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies.</a> General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).</li><li>Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pituitary+cells+in+primary+culture+to+study+the+secretion+in+rainbow-trout+-+Setting+up+and+validating+the+system+as+assessed+by+its+responsiveness+to+mammalian+and+salmon+gonadotropin-releasing+hormone.">Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone.</a> General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).</li><li>Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+dispersed+pituitary+cells+from+estradiol-pretreated+female+silver+eels+(Anguilla+anguilla+L):+Immunocytochemical+characterization+of+gonadotropic+cells+and+stimulation+of+gonadotropin+release.">Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release.</a> General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).</li><li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells.">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li><li>Lin, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+gonadotropins+(FSH+and+LH)+and+growth+hormone+(GH)+by+neuroendocrine,+endocrine,+and+paracrine+factors+in+the+zebrafish-An+in+vitro+approach.">Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach.</a> General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO2,+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH.</a> General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+-+a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka - a model organism from the far East.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).</li><li>Matsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMY+is+a+Y-specific+DM-domain+gene+required+for+male+development+in+the+medaka+fish.">DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish.</a> Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).</li><li>Kasahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medaka+draft+genome+and+insights+into+vertebrate+genome+evolution.">The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution.</a> Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Letters. 2 (12), (2016).</li><li>Waymouth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolality+of+mammalian+blood+and+of+media+for+culture+of+mammalian+cells.">Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells.</a> In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).</li><li>Cameron, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis+-+past+and+present+perspectives.">Acid-base homeostasis - past and present perspectives.</a> Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).</li><li>Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+regulation+in+fishes:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).</li><li>Perry, S. F., Tufts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish respiration. , (1998).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+&#946;-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone &#946;-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Strandab&#248;, R. A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality.">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Vitro hücre kültür sistemleri doğru şekilde1' de kullanılan bir bolluk farklı biyolojik soru cevap araştırmacılar için güçlü araçları sağlar. Onlar aslında içinde vivodaha onların bağlantı komşu hücrelere kaybetmiş Disosiye hücreleri farklı işlevsel özellikleri alınan olduğunu hatırlamak önemlidir. Vitro deneylerden elde edilen sonuçları misinterpreting riskini önlemek için faiz türler ve hücre türü birincil hücre kültür yordam...

Hücre kültürü normal Hücresel Fizyoloji uyuşturucu tarama ve karsinojenezis1' e kadar farklı biyolojik sorulara cevap için bir mükemmel model sistemi sağlayan moleküler biyolojik araştırmalarda kullanılan ana araçlardan biridir. Primer hücre, enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle hayvan dokudan doğrudan izole çoğu zaman daha biyolojik olarak çok hücre satır ilgili biyolojik yanıt vivo içinde durumuna yakın olabilir olarak kabul edilir. Birincil hücre kültürleri hazırlanması için protokol faiz bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit ve fizyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için her tür ve hücre türü için optimize edilmelidir.
Benzer protokoller balık hücreler için birincil kültür koşulları açıklayan karşılaştırmada oldukça kıt olmakla birlikte çok sayıda protokolleri memeli hücre sistemler, kültür koşulları tanımlamak. Hücreleri sıcaklık, pH ve osmolalite hızlı değişikliklere açıktır ve ayrılma işlemi sırasında özellikle kırılgan. Ticari tuz çözümler ve kültür memeli hücre kültürleri için kullanılan ortam pH Tampon sistem (ler) ve osmolalite açısından özellikle teleost balık için uygun değillerdir. Bu, bu nedenle, ölçmek ve bu parametrelerin faiz türlerin fizyolojik ilgili düzeyleri çözümlerinize ayarlamak önemlidir.
Birincil hipofiz kültürleri ortak sazan da dahil olmak üzere birkaç teleost balık türleri yapılan (Cyprinus carpio)2,3, çim sazan (Ctenopharyngodon idella)4, akvaryum balığı (Carassius hava )5, gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss)6, Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebra balığı (Danio rerio)9, ve Atlantik morina (Gadus morhua)10. Faiz tür inkübasyon sıcaklığı ayarlama dışında bu protokoller birkaç senaryo üzerinden 7,2 pH 7.5 oksijen bir atmosferde için ilgi türünün suboptimal olabilir memeli benzeri koşulları Özeti inkübe içeren % 3-5 CO2. Buna ek olarak, belirsiz bu birincil hücre kültürlerinde birkaç hazırlamak için kullanılan çözümler osmolalite ayarlandı ve farklı çözümler arasında istikrarlı.
Geçerli protokol Atlantik morina10 birincil kültürlerle önceki çalışma dayanır ve için ayarlamalar inkübasyon sıcaklığı, osmolalite, pH ve pH Tampon sistemleri, karbon dioksit (pCO2), kısmi basınç oluşur medaka (O. latipes) fizyolojisi. Medaka Doğu Asya'ya yerel, küçük (3-4 cm) tatlı su balığı var. Üremek nispeten kolay ve birçok ortak balık hastalık11son derece dayanıklı olduğu gibi bu gün, bu dünyanın her yerinden birçok araştırma laboratuarında bir modeli tür olarak kullanılır. Sıcaklık toleransı 4 – 40 ° C11, kısa oluşturma süresi, şeffaf embriyolar, cinsiyet belirleme gen12ve sıralı genom13, yanı sıra çok da dahil olmak üzere bir model olarak medaka kullanmanın bir çok avantajı vardır diğer Mevcut genetik kaynakları.
Bu protokolü birincil kültür koşullarda medakas, balık tesiste tutulur 26 ° C sıcaklık eşleşecek şekilde optimize edilmiştir. Ayrıca, osmolalite Atlantik morina 290 mOsm/kg tatlı suda yaşayan medaka için tuzlu su içinde yaşayan 320 mOsm/kg dan azalır ve uygun olarak medaka plazma14osmolalite normal olduğunu. Buna karşılık, memeli plazma tipik osmolalite 275-295 mOsm15içinde aralıktır. Hayat içinde a değişiklik-in sıcaklık derecesi balık ve su, kan ve ekstraselüler sıvı pH ve arabellek kapasitesini balık memeliler farklı yapmak ile doğrudan temas halinde olan Solungaçlarım var. Memeli Kültür medya genellikle medya % 5 CO2 37 ° C'de oksijen havada bir standart atmosferine equilibrated yükleyen pH yaklaşık 7,4 neden tampon sistemleri dahil PH seviyesi sıcaklık bağımlı ve azalan bir sıcaklık16ile nötr pH (suya) artar değeri arasındadır. Tipik teleost balık plazma pH 7.7 7.917' ye aralıkları. Bu protokol optimizasyon pH 7.85 pH 7,75 medaka CO2 den % %0.5 1 artırarak 26 ° C'de muhafaza için 12 ° C'de tutulur COD azalma dahil.
Buna ek olarak, bikarbonat arabelleği kapasitesi balık ve memeliler oldukça farklıdır. CO2 kolayca balık solungaçları üzerinde değiştirilir ve suda pCO2 akciğer18pCO2 yalnızca küçük bir kısmını. Sıcaklık veya pCO2 pH ve tampon orta değiştirilir. Sonuç olarak, pH hem de memeli hücreleri kuluçka için önerilen pCO2 balık hücreler için en uygun olmadığı ve bu nedenle, Kültür medya balık için fizyolojik ilgili değerleri içeren tampon sistemleri ile optimize ve belirli tür ilgi. Bu iletişim kuralı medaka pituitaries birincil hücre kültürleri hazırlamak ve kuluçka sıcaklık, osmolalite, pH ve pH Tampon sistemi, birincil hücre hazırlanırken göz önünde bulundurulacak diğer önemli parametrelere ek ayarlamalar dahil açıklar kültürler memeli olmayan türler.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D8537</td><td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td></tr><tr><td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>L5520</td><td>Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &amp;micro;m PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5881</td><td>Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5761</td><td>10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; equals 420 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>63565</td><td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&amp;nbsp; D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td><td>35050-061</td><td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>P0781</td><td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 &amp;micro;g/mL Streptomycin).</td></tr><tr><td>Trypsin type II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T7409</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution.</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T6522</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 &amp;micro;g/ml Dnase I (see details below).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D5025</td><td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td></tr><tr><td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>Straight tip</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>Angled 45&amp;deg; tip</td></tr><tr><td>Stereo microscope SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>Use for dissection of pituitaries.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Techne (Staffordshire, UK)</td><td></td><td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td></tr><tr><td>Pasteur glass pipettes</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td></tr><tr><td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>Any small table centrigue will do.</td></tr><tr><td>Fine needles/insect pins</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td></tr><tr><td>Wax plate</td><td></td><td></td><td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td></tr></tbody></table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Birincil hücre kültürü yaygın hücresel özellikleri ve izole hücreler kontrollü bir ortamda mekanizmaları incelemek için bilim adamları tarafından kullanılan güçlü bir araçtır. Memeliler ve balık arasında Fizyoloji büyük farklılıklara rağmen birincil hücre kültür balık iletişim kurallarından kez kez küçük değişiklikler ile memeli kültür koşulları temel alır. Çevre farklılıklar sadece vücut sıcaklığı, aynı zamanda kan serum parametreleri osmolalite, pH ve pH Tampon kapasitesi gibi etkiler. Hücre kültür medya ve benzer çalışma çözümleri ekstraselüler sıvı ve/veya kan serumu bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit içindir gibi bu parametreler söz konusu hayvan için özel olarak ayarlanır önemlidir.
Geçerli protokol medaka (Oryzias latipes) için en iyi duruma getirilmiş birincil kültür koşulları açıklar. Protokol yalıtmak ve sağlıklı korumak konusunda ayrıntılı adımlar ayrışmış hipofiz hücreleri bir haftadan fazla sağlar ve aşağıdaki adımları içerir: 1. osmolalite değerlere ayarlama bulundu medaka kan plazması, 2. ayarlaması inkübasyon sıcaklığı normal medaka sıcaklığa (burada akvaryum tesiste) ve 3. pH ve bikarbonat arabellek değerlerle karşılaştırılabilir benzer sıcaklıklarda yaşayan diğer balık türleri için uyum. Sonuçları açıklanan protokolü kullanılarak sunulan fizyolojik açıdan anlamlı sonuçlar medaka için teşvik ve bir başvuru kılavuzu olarak birincil hücre kültürleri diğer memeli olmayan tür yapım bilim adamları tarafından kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı bir birincil hücre kültürü medaka pituitaries üzerinden hazırlanması açıklar ve bir kültürde en az bir hafta için korunabilir sağlıklı hücreleri sağlar. Protokol medaka14 için fizyolojik ilgili değerleri temel alarak ve ayrıca hipofiz doku yetişkin balık, doku kaplama için hasat--dan tüm prosedürü sırasında 7,75 pH ve bir osmolalite 290 mOsm/kg kullanarak için optimize edilmiştir hücre kültürü (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Burada biz hazırlamak ve medaka (Oryzias latipes) birincil hipofiz hücre kültürleri korumak için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş koşullarda sıcaklık, osmolalite ve pH gibi önemli parametreleri göz önünde bulundurun fizyolojik şartlarda, böylece fizyolojik olarak daha anlamlı sonuçlar etkinleştirme balık, taklit ederek.

Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

preparation-high-quality-primary-cell-culture-from-fish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Görüntüleme.  Norwegian University of Life Sciences. Burada biz hazırlamak ve medaka (Oryzias latipes) birincil hipofiz hücre kültürleri korumak için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş koşullarda sıcaklık, osmolalite ve pH gibi önemli parametreleri göz önünde bulundurun fizyolojik şartlarda, böylece fizyolojik olarak daha anlamlı sonuçlar etkinleştirme balık, taklit ederek.

Video: Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Gelişim Biyolojisi

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Biyoloji

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Tıp

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Nörobilim

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Tek Hücreli Dizileme için Nil Tilapia Bağırsağından Tek Hücreli Süspansiyon Hazırlığı

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Generation of Primary Retinal Ganglion Cell Cultures From Zebrafish Embryos

Source: Terzi, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/62165">ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing primary retinal ganglion cells from zebrafish embryos. Early-stage embryos undergo dissection to isolate the eyes, which are subsequently mechanically dissociated into a suspension of retinal ganglion cells. This cell suspension is cultured on coverslips coated with adhesive proteins to facilitate axon development.

Zebra Balığı Embriyolarından Primer Retinal Ganglion Hücre Kültürlerinin Üretilmesi

1. Preparation of solutions

	E2 media (1x)
	
		Prepare 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) and 500x E2C (100 mL) solutions by combining all components ...