Bu proje, yaşam bilimleri ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numarası 243811 ve 244461 (su ürünleri programı) Norveççe üniversite tarafından finanse edildi. Balık tesisi korumak için Lourdes Carreon Tan yaşam bilimleri Norveççe Üniversitesi için minnettarız.

Bu çalışmada gerçekleştirilen hayvan deneyleri yaşam bilimleri, bakım ve araştırma hayvan refahı için aşağıdaki yönergeleri Norveççe Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlanması çözümleri
<ol><li>Osmometer ve pH metre aletleri doğru ölçümler emin olmak için üreticinin yönergelerine göre kalibre.</li>
	<li>
Ca2 +- ve Mg2 +500 mL hazırlamak-7,75 (adım 1.2.1) için pH ve 290 mOsm/kg (adım 1.2.2) steril filtrasyon (adım 1.2.3) önce osmolalite ayarlama Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (dPBS), ücretsiz.
	<ol>
<li>PH 7,75 için kalibre edilmiş pH metre ile dikkatli bir şekilde çözüm dikkatle karıştırarak 1 M NaOH çözüm damla ekleyerek ayarlayın.</li>
		<li>Kalibre edilmiş bir osmometer kullanarak çözüm osmolalite ölçmek ve mannitol osmolalite 290 mOsm/kg artırmak için gerekli miktarı hesaplar. Mannitol gerekli miktarda ekleyin ve sonra yeniden doğru uyum sağlamak için çözüm osmolalite ölçmek. Not: Genellikle farklı gruplar arasında değişir osmolalite ölçülen, mannitol gerekli miktarı bağlıdır. Bir molekül mannitol 1 ozmotik parçacık eşittir.</li>
		<li>Steril-filtre 0.2 µm filtre kullanarak dPBS çözüm. Not: Çözüm için en az 3 ay 4 ° C'de depolanmış olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L-glutamin ve bikarbonat olmadan iyi (L-15) kültür ortamının 500 mL hazırlamak ve bununla 10 mM NaHCO3 (adım 1.3.1), 4.5 mM glikoz (adım 1.3.2) ve 2 mM piyasada bulunan glutamin (adım 1.3.3) ekleyin. 290 mOsm/kg (adım 1.3.4), çözüm ayarlamak steril filtre bu (1.3.5. adım) ve 2.5 mL penisilin-streptomisin çözeltisi (adım 1.3.6) ekleyin. Not: Çözüm için en az 4 hafta 4 ° C'de depolanmış olabilir.<ol>
<li>NaHCO bir 10 mM çözümü elde etmek kültür ortamının 500 mL3 420 mg ekleyin.</li>
		<li>405 mg glikoz 4.5 mM çözüm elde etmek için kültür ortamının 500 mL başına ekleyin.</li>
		<li>Bir glutamin çözeltinin 100 x stokunun 5 mL 500 mL 2 mM çözüm elde etmek için kültür ortamının ekleyin. Tüm solutes eriyene kadar karıştırın.</li>
		<li>Çözüm 290 mOsm/kg (1.2.2. adımda yapılır gibi) bir osmometer kullanarak mannitol ile ayarlayın.</li>
		<li>Steril bir filtrasyon 0.2 µm filtre kullanarak L-15 orta gerçekleştirin.</li>
		<li>Steril filtrasyonu sonra 2.5 mL 50 U/mL penisilin ve 50 µg/mL streptomisin için karşılık gelen bir penisilin-streptomisin çözeltisi ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mL 1 mg/mL (% 0,1) tripsin tip II-S (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS içinde çözünmüş kullanarak tripsin çözeltisi hazırlamak. Aliquots 2 ml steril plastik tüplerde yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın. Not: Aliquots 2 ml-20 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir.</li>
	<li>50 mL 1 mg/mL (% 0,1) tripsin inhibitörü türü ben-s kullanarak tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlamak ve 2 µg/mL (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS içinde çözünmüş DNaz ile ek. Aliquots 2 ml steril plastik tüplerde yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın. Not: Aliquots 2 ml-20 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir.</li>
</ol>2. ekipman hazırlanması
<ol><li>Cam pipetler hücre ayrılma için belgili tanımlık uç parlatma yangın hazırlayın. 2 farklı boyutta kategoriler ile keyif yapmak (0,6-0,8 Orta bir açılış µm ve 0.4-0.6 küçük bir açılış µm) oynayarak zaman ve alev olan uzaklığı ile aynı anda pipet dönüm. Cam pipetler bir temiz cam kaba ve Otoklav (katı modu 105 ° C için 45 dk kullanarak) yerleştirin.</li>
	<li>Buz polistren kutusuyla hazırlayın.</li>
	<li>Değiştirilmiş dPBS (1.2 adımda hazırlanan) 1,5 mL plastik bir boru pituitaries için diseksiyon sırasında aktarmak ve buz üzerinde tutmak için hazır olun.</li>
	<li>15 mL tüp 10 mL (1.2 adımda hazırlanan) değiştirilmiş dPBS ile hazırlamak ve hücre ayrılma kadar buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Taze hazırlamak veya aliquots tripsin ve tripsin inhibitörü çözümleri (1.4 ve 1.5 adımlarda hazır) çözülme ve buza kadar kullanmak saklayın.</li>
	<li>Su banyosu 26 ° C-su pituitaries kimyasal ayrışma önce istenilen sıcaklık ulaşmak izin vermek için diseksiyon başlamadan önce ayarlayın.</li>
	<li>Tüm diseksiyon araçları % 70 etanol ile önce sırasında ve sonrasında kullanım, balık yıkmaya diseksiyon ve ince iğneler ve balmumu plaka için kullanılacak iyi forseps dahil olmak üzere temiz. Temiz eldiven kullanın (değiştirmek ve sık sık temiz) hücrelerin bir potansiyel kirlenmesini önlemek için bütün prosedür sırasında.</li>
</ol>3. hipofiz diseksiyon ve hücre ayrılma
<ol><li>Balık Ice slush (0 ° C) çeker tarafından ötenazi. Balık Ice slush geri dönüşü olmayan bir hipotermik şok emin olmak en az 1 dakika bırakın. Not: Bir kaç saniye sonra immobilizasyon ve denge kaybı ortaya çıkar. Balık buzlu suda tamamen sular altında ve buz üstünde tepe-in ikinci boğulma için yol açacak ve potansiyel cilt yerine hızlı ve insancıl hipotermik şok yakar gibi yalan yok emin olun.</li>
	<li>Çabuk, bir balık bir balmumu plakasına diseksiyon mikroskop altında transfer ve boyun ile çelik yerli tarafından omurga yok.</li>
	<li>Bir iğne (ağız) üzerinden açık ve başından (beyin) arkasında her tarafında bir diseksiyon kafasına dengelemeye koyarak ince iğneler, kullanarak balmumu plaka balık başkanı pin.</li>
	<li>Balık diseksiyon mikroskop altında görüntüleyebilir ve yavaşça ölçekler iyi forseps ile açılı bir ipucu kullanarak başın üst kapalı kazımak.</li>
	<li>Dikkatle cilt altında iyi forseps açılı ucu baş taraftan ekleyip yavaşça forseps kafatası çatı kapsayan forseps bir tutuş tutarken agiz cizgisi, yönde hareket ettirerek kafatası çatı kaldırabilirsiniz.</li>
	<li>Omurilik tamamen forseps ile açılı bir ucu kullanarak kesti. Not: Zaman önemli bir faktör, bu yüzden iş verimli ve hücreleri tabakta kaplama kadar doğru bir şekilde pituitaries diseksiyon süreyi sınırlamak için harcanan. Biraz pratik sonra hipofiz diseksiyon yaklaşık 2-3 dk balık, başına sadece 10 etrafında almalısınız s beyin zaten maruz kaldığında hipofiz almaya ihtiyaç vardır.</li>
	<li>Dikkatle beyin hipofiz ortaya çıkarmak ve düz bir ipucu ile temiz forseps ile incelemek için ağız doğru çevirin. Hipofiz değiştirilmiş 1.5 mL dPBS içeren bir plastik tüp transferi (ayrıntılı bilgi için bkz: adım 2.3) buz üzerinde yerleştirilir. Hipofiz başarıyla tüp eklenir ve hiçbir şey üzerinde pensler kaldı emin olmak için mikroskop altında pens ucunu kontrol edin. Not: aynı anda hazırlıklı olmak için gidiyoruz kültür yemekleri sayısına bağlı olarak gerektiğinde çok pituitaries incelemek. Pratik bir kural olarak, yetişkin balık (hangi aşağı akım uygulamaya bağlıdır) uygun bir yoğunluk hücre için çanak başına en az 10 pituitaries hesaplayın.</li>
	<li>Spin aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj pituitaries. Dikkatle cam pipet kullanarak dPBS kaldırmak ve herhangi bir pituitaries kaldırma önlemek için dikkat ediniz.</li>
	<li>Pituitaries yıkama, onları 1-2 s için masa üstü bir santrifüj içinde spin aşağı ve ek 1 mL tripsin çözeltisi eklemeden önce bir cam pipet kullanarak sıvı çoğu kaldırmak için 1 mL (1.4 adımda hazırlanan) tripsin çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Bir su banyosu için tercihen ile nazik sallayarak, 30 dk, 26 ° C'de tüpte kuluçkaya veya alternatif olarak, tüp birkaç kez kuluçka süresi boyunca hafifçe vur.</li>
	<li>Spin aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj pituitaries ve tüm pituitaries tüp alt kısmında yer olduğundan emin olun. Cam Pipet tripsin çözümle çoğunu kaldırın ve tripsin devre dışı bırakın ve pituitaries yıkamak için 1 mL (1.5 adımda hazırlanan) tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Tüpün dibinde pituitaries onları aşağı içinde oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj iplik tarafından toplamak. Cam Pipet ile sıvı çoğu kaldırın ve 1 mL (1.5 adımda hazırlanan) tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin. Bir su banyosu için tercihen nazik sallayarak ile 20 dk, 26 ° C'de tüpü yerleştirin veya alternatif olarak, birkaç kez tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için kuluçka döneminde tüpü hafifçe vur.</li>
	<li>L-15 orta 2 mL ekleyerek ve bunu doğru sıcaklık ve pH hücreleri kaplama önce erişebilmesi için en az 10 dk 26 ° c ve % 1 CO2 kuluçkaya izin Merkez cam alt ile bir 35 mm poli-d-lizin-kaplı hücre kültür yemek hazırlamak. Not: Bir plastik hücre kültür yemek de kullanılabilir. Bir yemek ile merkezi cam alt kullanarak ana avantajı hücreleri nerede kaplama alanı küçükse ve bu nedenle, daha az hipofiz hücreleri çanak gereklidir olmasıdır. Akış aşağı bazı uygulamalar da bir cam alt (yani, bazı görüntüleme teknikleri) gerektirebilir.</li>
	<li>15 mL tüpler için soğutma santrifüj 4 ° C mekanik ayrışma başlamadan önce istenilen sıcaklık ulaşmak izin vermek için ayarlayın.</li>
	<li>Pituitaries iplik metroyla altındaki aşağı oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj tripsin inhibitörü çözümde (Kimden adım 3.11) ile tüp ve toplamak tüm pituitaries daha önce tüp dibinde yer olduğundan emin olun dikkatle Cam Pipet kullanarak tripsin inhibitörü çözüm çoğunu kaldırılıyor. Not: hücreleri kirlenmesini önlemek hücre iş için sertifikalı tüm aşağıdaki adımları bir laminar akış Bank (SMD) protokolü uygulayın.</li>
	<li>1 mL (2.4 adımda hazırlanan) buz gibi değiştirilmiş dPBS hipofiz doku parçaları ekleyin ve hafifçe (2.1 adımda hazırlanan) bir Yangın Cilalı Cam Pipet içinde doku parçaları (6-7 x) yukarı ve aşağı emmek. Not: Sıcaklık önemli bir yönü, yani tüm çözümler 4 ° C'de tutmak Bu noktadan itibaren buza mümkün olduğunda tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Spin aşağı doku parçalar halinde oda sıcaklığında 1-2 s için masa üstü bir santrifüj ve dikkatle buza yerleştirilen yeni bir 15 mL tüp Disosiye hücreleri (hemen hemen 1 mL) içeren dPBS üst kısmındaki aktarın. Doku parçaları bıraktığı pipet tüp alt doğru hareket kaçının.</li>
	<li>Buz gibi dPBS 1 mL hücrelerde dPBS tüm 10 mL kullanılana kadar teker teker dissociating 3,16-3,17, adımları yineleyin. Bir orta ölçekli açılış ve Cam Pipet sonuna doğru daha küçük bir açılış ile geçiş ile Cam Pipet (son 3-4 mL için eklendi dPBS) ayrılma kullanmaya başlamak. Yapıya ait hala görülebilen doku parçaları ayrılma yordam sonuna doğru iseniz, dPBS ayrılma için 2 son adım doğru yaklaşık 10 x pipetting artırmak ve sonunda kalan doku parçaları geride. Hücreleri nazikçe resuspend ve hücreleri kabarcıkları yüzeye iliştirdiğinizde hücre hasarı neden olabilir gibi kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Not: Bu bir kritik adım bu protokol ve iyi bir sonuç elde etmek için bazı eğitim gerektirir.</li>
	<li>Tüp (4 ° C-önceden soğutmalı) santrifüj ve hücreleri 200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de aşağı spin denge Nerede cep Pelet olacak tüp tarafında işaretlemek emin olun.</li>
	<li>Dikkatle santrifüj tüpü çıkarması ve yavaşça süpernatant cam pipet ile bir boş 15 mL plastik tüp doğrudan Santrifüjü sonra transfer. Çoğu süpernatant kaldırmak ancak küçük (genellikle görünmez) hücre Pelet kaybetmemek için dikkat çekmek emin olun.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde hücre Pelet L-15 kültür orta 50-100 µL içinde resuspend. Not: Bu adımda, bu hücreleri saymak ve/veya bir canlılık testi (örneğin sayım varlığı trypan mavi bir hemasitometre kullanarak bir hücreye) gerçekleştirmek ama bu amaç için hücre süspansiyon parçası kullanarak verimi düşürür dikkat mümkündür. Bu çanak merkezi dışında difüzyon hücreleri riskini artıracaktır gibi bir büyük süspansiyon birim kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Dikkatle Disosiye hücreleri (3.13 adımda hazırlanan) L-15 orta 2 mL içeren hücre kültür çanak ortasında damla. Cam alt batık parçası dışında yayılmış hücreler zorunda kalmamak için kuluçka makinesi, geçmeden önce yemek için yaklaşık 5 dk altına batmaya hücreleri izin.</li>
	<li>Tüm hücreler iyice lavabo ve çanak alt kısmına eklemek izin vermek için 26 ° C ve % 1 CO2 çanak kuluçkaya.</li>
	<li>30 dakika sonra kültür yemek için ekli var emin olmak için mikroskop hücrelerde bakın.</li>
	<li>26 ° C ve % 1 CO2hücreleri kuluçkaya devam'i tıklatın.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde değiştirmek orta her 3-4 günde en çok (ama hepsi değil). Not: Bu hücreleri rahatsız ve onları cam alt kısmından ayırmak gibi orta daha sık değiştirmekten kaçının. Hücreleri deneyler için onları tohum sonra bir hafta içinde kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Ribeiro, L. P., Ahne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cell+culture:+initiation+of+a+line+of+pituitary+cells+from+carp+(Cyprinus+carpio)+to+study+the+release+of+gonadotropin+in+vitro.">Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro.</a> In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).</li><li>Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+normal+pituitary+cells+of+carp+(Cyprinus+carpio)+for+the+study+of+gonadotropin+release.">Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release.</a> In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).</li><li>Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+inhibits+(d-Arg6,+Pro9-NEt)+salmon+gonadotropin-releasing+hormone-+and+dopamine+D1-stimulated+growth+hormone+release+from+perifused+pituitary+cells+of+chinese+grass+carp,+Ctenopharyngodon+idellus.">Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus.</a> General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).</li><li>Chang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+pituitary+cell+dispersion+method+and+primary+culture+system+for+the+studies+of+gonadotropin-releasing+hormone+action+in+the+goldfish,+Carassius+auratus.+I.+Initial+morphological,+static,+and+cell+column+perifusion+studies.">Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies.</a> General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).</li><li>Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pituitary+cells+in+primary+culture+to+study+the+secretion+in+rainbow-trout+-+Setting+up+and+validating+the+system+as+assessed+by+its+responsiveness+to+mammalian+and+salmon+gonadotropin-releasing+hormone.">Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone.</a> General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).</li><li>Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cultures+of+dispersed+pituitary+cells+from+estradiol-pretreated+female+silver+eels+(Anguilla+anguilla+L):+Immunocytochemical+characterization+of+gonadotropic+cells+and+stimulation+of+gonadotropin+release.">Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release.</a> General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).</li><li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells.">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li><li>Lin, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+gonadotropins+(FSH+and+LH)+and+growth+hormone+(GH)+by+neuroendocrine,+endocrine,+and+paracrine+factors+in+the+zebrafish-An+in+vitro+approach.">Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach.</a> General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).</li><li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+conditions+for+primary+culture+of+pituitary+cells+from+the+Atlantic+cod+(Gadus+morhua).+The+importance+of+osmolality,+pCO2,+and+pH.">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH.</a> General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+-+a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka - a model organism from the far East.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).</li><li>Matsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMY+is+a+Y-specific+DM-domain+gene+required+for+male+development+in+the+medaka+fish.">DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish.</a> Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).</li><li>Kasahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+medaka+draft+genome+and+insights+into+vertebrate+genome+evolution.">The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution.</a> Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).</li><li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka,+Oryzias+latipes.">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Letters. 2 (12), (2016).</li><li>Waymouth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolality+of+mammalian+blood+and+of+media+for+culture+of+mammalian+cells.">Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells.</a> In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).</li><li>Cameron, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+homeostasis+-+past+and+present+perspectives.">Acid-base homeostasis - past and present perspectives.</a> Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).</li><li>Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+regulation+in+fishes:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms.</a> Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).</li><li>Perry, S. F., Tufts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish respiration. , (1998).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+&#946;-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone &#946;-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Strandab&#248;, R. A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes).">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li><li>Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+volume+regulation+in+response+to+changes+in+osmolality.">Brain volume regulation in response to changes in osmolality.</a> Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Vitro hücre kültür sistemleri doğru şekilde1' de kullanılan bir bolluk farklı biyolojik soru cevap araştırmacılar için güçlü araçları sağlar. Onlar aslında içinde vivodaha onların bağlantı komşu hücrelere kaybetmiş Disosiye hücreleri farklı işlevsel özellikleri alınan olduğunu hatırlamak önemlidir. Vitro deneylerden elde edilen sonuçları misinterpreting riskini önlemek için faiz türler ve hücre türü birincil hücre kültür yordam...

Hücre kültürü normal Hücresel Fizyoloji uyuşturucu tarama ve karsinojenezis1' e kadar farklı biyolojik sorulara cevap için bir mükemmel model sistemi sağlayan moleküler biyolojik araştırmalarda kullanılan ana araçlardan biridir. Primer hücre, enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle hayvan dokudan doğrudan izole çoğu zaman daha biyolojik olarak çok hücre satır ilgili biyolojik yanıt vivo içinde durumuna yakın olabilir olarak kabul edilir. Birincil hücre kültürleri hazırlanması için protokol faiz bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit ve fizyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için her tür ve hücre türü için optimize edilmelidir.
Benzer protokoller balık hücreler için birincil kültür koşulları açıklayan karşılaştırmada oldukça kıt olmakla birlikte çok sayıda protokolleri memeli hücre sistemler, kültür koşulları tanımlamak. Hücreleri sıcaklık, pH ve osmolalite hızlı değişikliklere açıktır ve ayrılma işlemi sırasında özellikle kırılgan. Ticari tuz çözümler ve kültür memeli hücre kültürleri için kullanılan ortam pH Tampon sistem (ler) ve osmolalite açısından özellikle teleost balık için uygun değillerdir. Bu, bu nedenle, ölçmek ve bu parametrelerin faiz türlerin fizyolojik ilgili düzeyleri çözümlerinize ayarlamak önemlidir.
Birincil hipofiz kültürleri ortak sazan da dahil olmak üzere birkaç teleost balık türleri yapılan (Cyprinus carpio)2,3, çim sazan (Ctenopharyngodon idella)4, akvaryum balığı (Carassius hava )5, gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss)6, Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, zebra balığı (Danio rerio)9, ve Atlantik morina (Gadus morhua)10. Faiz tür inkübasyon sıcaklığı ayarlama dışında bu protokoller birkaç senaryo üzerinden 7,2 pH 7.5 oksijen bir atmosferde için ilgi türünün suboptimal olabilir memeli benzeri koşulları Özeti inkübe içeren % 3-5 CO2. Buna ek olarak, belirsiz bu birincil hücre kültürlerinde birkaç hazırlamak için kullanılan çözümler osmolalite ayarlandı ve farklı çözümler arasında istikrarlı.
Geçerli protokol Atlantik morina10 birincil kültürlerle önceki çalışma dayanır ve için ayarlamalar inkübasyon sıcaklığı, osmolalite, pH ve pH Tampon sistemleri, karbon dioksit (pCO2), kısmi basınç oluşur medaka (O. latipes) fizyolojisi. Medaka Doğu Asya'ya yerel, küçük (3-4 cm) tatlı su balığı var. Üremek nispeten kolay ve birçok ortak balık hastalık11son derece dayanıklı olduğu gibi bu gün, bu dünyanın her yerinden birçok araştırma laboratuarında bir modeli tür olarak kullanılır. Sıcaklık toleransı 4 – 40 ° C11, kısa oluşturma süresi, şeffaf embriyolar, cinsiyet belirleme gen12ve sıralı genom13, yanı sıra çok da dahil olmak üzere bir model olarak medaka kullanmanın bir çok avantajı vardır diğer Mevcut genetik kaynakları.
Bu protokolü birincil kültür koşullarda medakas, balık tesiste tutulur 26 ° C sıcaklık eşleşecek şekilde optimize edilmiştir. Ayrıca, osmolalite Atlantik morina 290 mOsm/kg tatlı suda yaşayan medaka için tuzlu su içinde yaşayan 320 mOsm/kg dan azalır ve uygun olarak medaka plazma14osmolalite normal olduğunu. Buna karşılık, memeli plazma tipik osmolalite 275-295 mOsm15içinde aralıktır. Hayat içinde a değişiklik-in sıcaklık derecesi balık ve su, kan ve ekstraselüler sıvı pH ve arabellek kapasitesini balık memeliler farklı yapmak ile doğrudan temas halinde olan Solungaçlarım var. Memeli Kültür medya genellikle medya % 5 CO2 37 ° C'de oksijen havada bir standart atmosferine equilibrated yükleyen pH yaklaşık 7,4 neden tampon sistemleri dahil PH seviyesi sıcaklık bağımlı ve azalan bir sıcaklık16ile nötr pH (suya) artar değeri arasındadır. Tipik teleost balık plazma pH 7.7 7.917' ye aralıkları. Bu protokol optimizasyon pH 7.85 pH 7,75 medaka CO2 den % %0.5 1 artırarak 26 ° C'de muhafaza için 12 ° C'de tutulur COD azalma dahil.
Buna ek olarak, bikarbonat arabelleği kapasitesi balık ve memeliler oldukça farklıdır. CO2 kolayca balık solungaçları üzerinde değiştirilir ve suda pCO2 akciğer18pCO2 yalnızca küçük bir kısmını. Sıcaklık veya pCO2 pH ve tampon orta değiştirilir. Sonuç olarak, pH hem de memeli hücreleri kuluçka için önerilen pCO2 balık hücreler için en uygun olmadığı ve bu nedenle, Kültür medya balık için fizyolojik ilgili değerleri içeren tampon sistemleri ile optimize ve belirli tür ilgi. Bu iletişim kuralı medaka pituitaries birincil hücre kültürleri hazırlamak ve kuluçka sıcaklık, osmolalite, pH ve pH Tampon sistemi, birincil hücre hazırlanırken göz önünde bulundurulacak diğer önemli parametrelere ek ayarlamalar dahil açıklar kültürler memeli olmayan türler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>L5520</td>
			<td>Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &#181;m PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>S5761</td>
			<td>10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>63565</td>
			<td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>G5400</td>
			<td>4.5 mM&#160; D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 &#181;g/ml Streptomycin).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin type II-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T7409</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>T6522</td>
			<td>Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 &#181;g/ml Dnase I (see details below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td>
			<td>D5025</td>
			<td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td>
			<td>Corning Inc. (Corning, NY)</td>
			<td>431097</td>
			<td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-10-C</td>
			<td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Straigt tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Angled 45&#176; tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td>Use for dissection of pituitaries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alegra X-22R Centrufuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td>
			<td></td>
			<td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Techne (Staffordshire, UK)</td>
			<td></td>
			<td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur glass pipettes</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>612-1701</td>
			<td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td>
			<td>VWR (NY)</td>
			<td>521-2844</td>
			<td>Any small table centrigue will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine needles / insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools (CA)</td>
			<td>26001-40</td>
			<td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Birincil hücre kültürü yaygın hücresel özellikleri ve izole hücreler kontrollü bir ortamda mekanizmaları incelemek için bilim adamları tarafından kullanılan güçlü bir araçtır. Memeliler ve balık arasında Fizyoloji büyük farklılıklara rağmen birincil hücre kültür balık iletişim kurallarından kez kez küçük değişiklikler ile memeli kültür koşulları temel alır. Çevre farklılıklar sadece vücut sıcaklığı, aynı zamanda kan serum parametreleri osmolalite, pH ve pH Tampon kapasitesi gibi etkiler. Hücre kültür medya ve benzer çalışma çözümleri ekstraselüler sıvı ve/veya kan serumu bir hücre adapte olduğu özelliklerini taklit içindir gibi bu parametreler söz konusu hayvan için özel olarak ayarlanır önemlidir.
Geçerli protokol medaka (Oryzias latipes) için en iyi duruma getirilmiş birincil kültür koşulları açıklar. Protokol yalıtmak ve sağlıklı korumak konusunda ayrıntılı adımlar ayrışmış hipofiz hücreleri bir haftadan fazla sağlar ve aşağıdaki adımları içerir: 1. osmolalite değerlere ayarlama bulundu medaka kan plazması, 2. ayarlaması inkübasyon sıcaklığı normal medaka sıcaklığa (burada akvaryum tesiste) ve 3. pH ve bikarbonat arabellek değerlerle karşılaştırılabilir benzer sıcaklıklarda yaşayan diğer balık türleri için uyum. Sonuçları açıklanan protokolü kullanılarak sunulan fizyolojik açıdan anlamlı sonuçlar medaka için teşvik ve bir başvuru kılavuzu olarak birincil hücre kültürleri diğer memeli olmayan tür yapım bilim adamları tarafından kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı bir birincil hücre kültürü medaka pituitaries üzerinden hazırlanması açıklar ve bir kültürde en az bir hafta için korunabilir sağlıklı hücreleri sağlar. Protokol medaka14 için fizyolojik ilgili değerleri temel alarak ve ayrıca hipofiz doku yetişkin balık, doku kaplama için hasat--dan tüm prosedürü sırasında 7,75 pH ve bir osmolalite 290 mOsm/kg kullanarak için optimize edilmiştir hücre kültürü (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries at JoVE.com

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Burada biz hazırlamak ve medaka (Oryzias latipes) birincil hipofiz hücre kültürleri korumak için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş koşullarda sıcaklık, osmolalite ve pH gibi önemli parametreleri göz önünde bulundurun fizyolojik şartlarda, böylece fizyolojik olarak daha anlamlı sonuçlar etkinleştirme balık, taklit ederek.

Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

preparation-high-quality-primary-cell-culture-from-fish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Görüntüleme.  Norwegian University of Life Sciences. Burada biz hazırlamak ve medaka (Oryzias latipes) birincil hipofiz hücre kültürleri korumak için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş koşullarda sıcaklık, osmolalite ve pH gibi önemli parametreleri göz önünde bulundurun fizyolojik şartlarda, böylece fizyolojik olarak daha anlamlı sonuçlar etkinleştirme balık, taklit ederek.

Video: Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Yüksek-Kalite Dijital Video Edinme<em&gt; Drosophila</em&gt; Bir Yanal Perspektifinden Larva ve Yetişkin Davranışları

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or regions from heterogenous tissues. Captured product can be used in a variety of molecular methods for protein, DNA or RNA isolation. However, preservation of RNA from postmortem human brain tissue is especially challenging. Standard visualization techniques for LCM require histologic or immunohistochemical staining procedures that can further degrade RNA. Therefore, we designed a stainless protocol for visualization in LCM with the intended purpose of preserving RNA integrity in post-mortem human brain tissue. The Purkinje cell of the cerebellum is a good candidate for stainless visualization, due to its size and characteristic location. The cerebellar cortex has distinct layers that differ in cell density, making them a good archetype to identify under high magnification microscopy. Purkinje cells are large neurons situated between the granule cell layer, which is a densely cellular network of small neurons, and the molecular layer, which is sparse in cell bodies. Because of this architecture, the use of stainless visualization is feasible. Other organ or cell systems that mimic this phenotype would also be suitable. The stainless protocol is designed to fix fresh-frozen tissue with ethanol and remove lipids with xylene for improved morphological visualization under high magnification light microscopy. This protocol does not account for other fixation methods and is specifically designed for fresh-frozen tissue samples captured using an ultraviolet (UV)-LCM system. Here, we present a full protocol for sectioning and fixing fresh frozen post-mortem human cerebellar tissue and purification of RNA from Purkinje cells isolated by UV-LCM, while preserving RNA quality for subsequent RNA-sequencing. In our hands, this protocol produces exceptional levels of cellular visualization without the need for staining reagents and yields RNA with high RNA integrity numbers (&#8805;8) as needed for transcriptional profiling experiments.

This protocol uses a stain-free approach to visualize and isolate Purkinje cells in fresh-frozen tissue from human post-mortem cerebellum via laser capture microdissection. The purpose of this protocol is to generate sufficient amounts of high-quality RNA for RNA-sequencing.

Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

Laser capture microdissection (LCM) is an advantageous tool that allows for the collection of cytologically and/or phenotypically relevant cells or ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...