Este protocolo descreve um método simples e reprodutível para purificar e culminar tipos específicos de neurônio primário. Essas culturas são adequadas para análise eletrofisiológica, morfológica e de sobrevivência. Culturas de neurônios purificados podem ser usadas para estudar fundamentos da fisiologia neuronal, formação de sinapses, bem como como as redes neuronais se desenvolvem.
Enquanto nos concentramos em células principais glutamatergicas corticais e interneurônios GABAérgicos, este procedimento pode ser facilmente modificado para estudar quaisquer linhas neuronais que expressem proteínas fluorescentes. Para preparar tampas de vidro, primeiro descongele uma alíquota de cinco mililitros de 200 microgramas por solução PLL mililitro. Diluir esta solução de estoque para 20 microgramas por mililitro adicionando 45 mililitros de água de grau de injeção pura.
Em seguida, o filtro esterilizar a solução em um novo tubo cônico de 50 mililitros e rotular este tubo como PLL estéril. Em seguida, coloque 100 tampas de vidro estéreis de 12 milímetros na solução PLL estéril. Agitar o tubo a cada cinco a 10 minutos durante dois a três minutos para garantir o revestimento uniforme.
Após 40 minutos de revestimento PLL, pegue dois pedaços de papel de tecido e coloque-os no armário de fluxo. Esterilize o papel usando 70% de etanol e depois achate para remover as dobras e deixe secar. Depois de revestir as tampas de vidro por uma hora com PLL, remova o excesso de solução PLL e adicione água de grau de injeção estéril.
Agitar suavemente as tampas por dois a três segundos para remover o excesso de PLL. Repita este passo de lavagem mais duas vezes. Remova o excesso de água e, em seguida, transfira as tampas para o papel de tecido estéril.
Uma vez seco, transfira as tampas para uma placa de cultura de 24 poços. Para preparar as soluções de cultura celular, meça 12 mililitros de tampão de cultura celular a um tubo cônico de 15 mililitros e rotule como BSA. Meça cinco mililitros de tampão de cultura celular para um tubo diferente de 15 mililitros e rotule como papain.
Posteriormente, incubar os dois tubos por 15 minutos a 37 graus Celsius. Adicione 120 miligramas de BSA ao tubo rotulado BSA. Em seguida, inverta o tubo para ajudar a dissolver a solução.
Em seguida, adicione sete miligramas de papain ao tubo rotulado papain. Devolva os dois tubos ao banho de água por 15 minutos. O filtro esteriliza a solução BSA em um tubo cônico fresco.
Divida a solução BSA estéril em três tubos e rotule cada tubo como Estéril BSA e um, dois ou três. Agora, o filtro esteriliza o tubo papain e rotule o tubo como papain estéril. Volte todos os tubos de volta ao banho de água e continue incubando a 37 graus Celsius até o uso.
Para se preparar para dissecção tecidual, coloque o bisturi, tesoura, fórceps e espátula necessários para a dissecção do hipocampo e córtex. Coloque duas placas de Petri de 35 milímetros e uma placa de Petri de 100 milímetros contendo papel filtro estéril no armário de fluxo. Coletar NexCre transgênico; Ai9 ou vesicular TRANSPORTADOR GABA Filhotes de rato venus que devem ser dissecados usando uma lâmpada fluorescente com filtros de excitação e emissão apropriados para discriminar filhotes fluorescentes de companheiros de litro tipo selvagem.
Imediatamente antes de dissecar os animais, preencha cada placa de Petri com tampão de cultura celular estéril refrigerado. Após a dissecção, transfira cuidadosamente o cérebro do filhote transgênico para um papel filtro estéril. Primeiro, disseque o cerebelo e separe os dois hemisférios.
Em seguida, separe cuidadosamente o hipocampo e o córtex de cada hemisfério. Transfira o tecido dissecado para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo tampão de cultura celular resfriado. Em seguida, transfira o hipocampo dissecado e o córtex para a tampa de outra placa de Petri de 35 milímetros.
Usando a borda plana de uma lâmina de bisturi, corte cuidadosamente o tecido em um movimento de cruzamento até que apenas pequenos pedaços permaneçam. Em seguida, transfira o tecido picado com uma pequena quantidade de solução de papain da tampa da placa de Petri para o tubo papain estéril. Incubar o tecido a 37 graus Celsius por 25 minutos.
Após a incubação do papain, transfira o tubo papain estéril e os tubos BSA estéreis para o armário de fluxo. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de um mililitro para transferir apenas o tecido corticohippocampal do tubo papain para o tubo BSA. A fim de quebrar qualquer grande aglomerado de tecido, triturar o tecido várias vezes usando uma pipeta Pasteur de um mililitro.
Na sequência, tritura o tecido sete vezes usando uma pipeta pasteur de ponta fina. Após 30 segundos, transfira um mililitro da solução inferior e tecido do tubo BSA um para o tubo BSA dois. Triturar o tecido no tubo BSA duas vezes usando uma pipeta pasteur de ponta fina.
Após a trituração, transfira um mililitro do tecido inferior e solução do tubo BSA um para o tubo BSA três. Triturar o tecido no tubo BSA três vezes. Após a trituração, transfira toda a solução e tecido dos tubos dois e três para o tubo BSA um.
Triturar mais duas ou três vezes e centrifugar a 3.000 vezes g por três minutos. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o supernacido do tecido pelleted e resuspende as células usando uma pipeta P1000 em dois mililitros de hibernação completa Um meio de baixa fluorescência. Em seguida, triturar o tecido 20 vezes para garantir a ressuspensão completa da solução tecidual.
Posteriormente, o arquivador a suspensão celular através de uma peneira de célula de 30 micrômetros em um tubo de amostra de poliestireno. Prepare os tubos de coleta de células, tubos de 300 microliters de hibernação completa Uma mídia para o número necessário de tubos de polipropileno. Para que cada tipo de célula fluorescente seja classificada, escolha os filtros de excitação e emissão apropriados.
Excite a proteína Vênus usando 488 comprimentos de onda de excitação de nanômetros e detecte a luz emitida através do conjunto de filtros de emissão 530/40. Excite a proteína TdTomato usando 531 nanômetros de comprimento de onda de excitação e detecte a luz emitida através do conjunto de filtros de emissão 575/30. Para alta pureza, classifique células fluorescentes brilhantemente rotuladas.
Após a triagem celular, transfira as células coletadas para dois tubos de centrífuga fundo redondo mililitro. Em seguida, centrifugar as células a 3.000 vezes g por três minutos para formar uma pelota celular. Resuspenque a pelota celular na quantidade necessária de meio NBA completo pré-aquecido para alcançar uma densidade celular de 1.000 células por microliter.
Para confirmar a presença de células dissociadas, verifique a solução celular sob um microscópio usando uma lente objetiva 4X ou 10X. Antes de emplaar as células, o vórtice a uma velocidade média por dois a três segundos para garantir uma suspensão uniforme da célula. Seguindo o vórtice, pipeta rapidamente 10 microliters da suspensão celular para o centro de cada deslizamento de tampa.
Após uma hora, alimente as células com 500 microliters de meio da NBA completo pré-aquecido e retorne à incubadora a 37 graus Celsius. Para co-cultivar os neurônios purificados e células gliais, passagem células gliais para o número necessário de inserções de cultura celular. Isso é feito emplacando 40.000 células gliais em uma gotícula de 500 microliter de meio completo da NBA.
Após uma hora, transfira a cultura celular gliana para neurônios purificados. Remova o excesso de mídia das pastilhas de cultura e devolva as placas à incubadora para cultivo. Após a triagem bem sucedida, os neurônios banhados devem aparecer em forma redonda com uma membrana lisa e devem ser vistos para poupar neuroides após aproximadamente uma hora in vitro.
Por sete dias in vitro, embora alguma morte celular possa ser aparente, células viáveis devem estar presentes em todas as condições culturais. A análise das culturas purificadas revela que tanto os neurônios glutamtericos quanto os gabaérgicos foram capazes de estender axônios e dendritos de seus corpos celulares e reter a capacidade de gerar potenciais de ação em resposta a injeções de correntes super limiares despolarizantes. Notavelmente após a purificação, apenas os neurônios GABAérgicos receberam quantidade significativa de transmissão sináptica espontânea e neurônios glutamatericos receberam muito pouca transmissão sináptica na ausência de células gliais.
É importante ressaltar que cultivar neurônios purificados com células gliais melhora o crescimento e a sobrevivência dos neurônios, bem como promove a transmissão sináptica em culturas glutamatergicas. O revestimento de polarização suficiente das tampas e a manutenção do pH fisiológico dos meios de cultura ao longo do procedimento são fundamentais para garantir culturas celulares de boa qualidade. Seguindo este protocolo, deve ser possível realizar sequenciamento de RNA e espectroscopia de massa proteica em culturas purificadas permitindo que processos translacionais e transcricionais sejam investigados em tipos neuronais específicos.
