Name: preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries
Uploaded: 2018-08-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
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Dieses Projekt wurde von der norwegischen Universität für Biowissenschaften und der Forschung Rat von Norwegen, Grant-Nummer 243811 und 244461 (Aquakultur Programm) finanziert. Wir sind dankbar, Lourdes Carreon Tan an der norwegischen Universität für Biowissenschaften für die Aufrechterhaltung der Fisch-Anlage.

Die Tierversuche durchgeführt in dieser Studie wurden von der norwegischen Universität für Biowissenschaften, folgende Richtlinien für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Kalibrieren Sie die XR und pH Meter-Instrumente nach den Anweisungen des Herstellers um korrekte Messungen zu gewährleisten.</li>
	<li>
Bereiten Sie 500 mL Ca2 +- und Mg2 +-freie Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS), Einstellung des pH-Werts auf 7,75 (Schritt 1.2.1) und der Osmolalität auf 290 mOsm/kg (Schritt 1.2.2) vor einer Sterilfiltration (Schritt 1.2.3).
	<ol>
<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit einem kalibrierten pH-Meter indem Sie sorgfältig Tropfen einer 1 M NaOH-Lösung die Lösung sorgfältig rühren.</li>
		<li>Messen Sie die Osmolalität der Lösung mit einem kalibrierten XR zu und berechnen Sie die Höhe der Mannit musste die Osmolalität auf 290 mOsm/kg zu erhöhen. Fügen Sie die erforderliche Menge an Mannit und Messen Sie dann die Osmolalität der Lösung wieder auf die richtige Einstellung zu gewährleisten. Hinweis: Die Höhe der Mannit benötigt richtet sich nach der Osmolalität gemessen, die in der Regel zwischen verschiedenen Chargen variiert. Ein Molekül Mannit entspricht 1 osmotischen Teilchen.</li>
		<li>Steril-Filter die dPBS Lösung mit einem 0,2 µm-Filter. Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens 3 Monate aufbewahrt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mL Kulturmedium Leibovitz (L-15) ohne L-Glutamin und Bikarbonat und ergänzen Sie es mit 10 mM Nahco33 (Schritt 1.3.1), 4,5 mM Glukose (Schritt 1.3.2) und 2 mM im Handel erhältlichen Glutamin (Schritt 1.3.3). Passen Sie die Lösung für 290 mOsm/kg (Schritt 1.3.4), Sterilfilter es (Schritt 1.3.5) und 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung (Schritt 1.3.6). Hinweis: Die Lösung kann für mindestens 4 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.<ol>
<li>Fügen Sie 420 mg Nahco33 pro 500 mL Kulturmedium eine 10 mM-Lösung zu erreichen.</li>
		<li>Fügen Sie 405 mg Glukose pro 500 mL Kulturmedium Herbeiführung eine 4,5 mM-Lösung hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 100 X Lager einer Glutamin-Lösung 5 mL in 500 mL Kulturmedium eine 2 mM-Lösung zu erreichen. Rühren Sie, bis alle gelösten Stoffen gelöst werden.</li>
		<li>Passen Sie die Lösung auf 290 mOsm/kg mit Mannit mit einer XR (wie in Schritt 1.2.2 ausgeführt).</li>
		<li>Führen Sie eine sterile Filtration des L-15 Mediums mit einem 0,2 µm-Filter.</li>
		<li>Fügen Sie nach der Sterilfiltration 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung, entsprechend 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %)-Trypsin-Typ II-S in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Inhibitor-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %) Trypsin Inhibitor Typ I-S und ergänzen Sie es mit 2 µg/mL DNase, die ich in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Ausrüstung
<ol><li>Bereiten Sie glaspipetten durch Feuer Polieren der Tipp für die Zelle Dissoziation vor. Tipps mit 2 verschiedenen Größenklassen zu machen (eine mittlere Öffnung von 0,6-0,8 µm und eine kleine Öffnung von 0,4 – 0,6 µm) durch das Spiel mit der Zeit und den Abstand von der Flamme und drehen Sie gleichzeitig die Pipette. Ablegen der glaspipetten in einem sauberen Behälter und Autoklaven (mit der solid-Modus bei 105 ° C für 45 min.).</li>
	<li>Bereiten Sie eine Styroporbox mit Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL veränderte dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) übertragen die Hypophysen, während der Präparation und halten sie auf dem Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 15 mL-Tube mit 10 mL der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) und lassen Sie ihn auf Eis, bis die Zelle Dissoziation.</li>
	<li>Frisch bereiten Sie zu oder tauen Sie Aliquote des Trypsin und Trypsin-Inhibitor-Lösungen (vorbereitet in Schritten 1.4 und 1.5 auf) und halten sie auf dem Eis bis zur Verwendung.</li>
	<li>26 ° C im Wasserbad vor Beginn der Dissektion damit das Wasser die gewünschte Temperatur vor der chemischen Dissoziation der Hypophysen erreichen soll.</li>
	<li>Reinigen Sie alle Dissektion Werkzeuge mit 70 % Ethanol, vor, während und nach dem Gebrauch, einschließlich feine Pinzette für die Zerlegung und feinen Nadeln und eine Wachs-Platte verwenden, um die Fische zu fixieren. Verwenden Sie saubere Handschuhe (ändern und häufig reinigen) während des gesamten Verfahrens um eine mögliche Verschmutzung der Zellen zu vermeiden.</li>
</ol>(3) die Hypophyse Dissektion und Zelle Dissoziation
<ol><li>Einschläfern der Fisch durch Eintauchen in Slush Eis (0 ° C). Lassen Sie den Fisch in den Matsch Eis mindestens 1 min. um eine irreversible hypothermen Schock zu gewährleisten. Hinweis: Immobilisierung und Gleichgewicht Verlust wird nach wenigen Sekunden auftreten. Stellen Sie sicher, der Fisch ist komplett in das Eis Wasser getaucht und liegt nicht auf dem Eis, da Letzteres zum ersticken führt und potenzielle Haut, anstatt einen schnellen und humane hypothermen Schock brennt.</li>
	<li>Schnell übertragen Sie die Fische in einem Netz auf einer Wachs-Platte unter dem Mikroskop Dissektion und zerstören Sie die Wirbelsäule durch eine Nadel Punch durch den Hals.</li>
	<li>Heften Sie den Kopf des Fisches, die Wachs-Platte mit feinen Nadeln, durch eine Nadel in der Front (über den Mund) und eine auf jeder Seite des Kopfes (hinter dem Gehirn) um den Kopf vor der Präparation zu stabilisieren.</li>
	<li>Sehen Sie die Fische unter dem Mikroskop Dissektion und vorsichtig abkratzen der Schuppen auf der Oberseite des Kopfes mit feinen Pinzette mit abgewinkelter Spitze.</li>
	<li>Sorgfältig führen Sie die abgewinkelte Spitze der feinen Zange unter die Haut von der Seite des Kopfes und entfernen Sie der Schädel-Dach, indem Sie langsam die Zange in die Richtung des Mundes, halten Sie einen festen Griff um die Zange umschließen das Schädel-Dach.</li>
	<li>Abschneiden des Rückenmarks komplett mit Pinzette mit abgewinkelter Spitze. Hinweis: Es ist ein wichtiger Faktor, so arbeiten effizient und genau die Zeit begrenzen verbrachte aus der Dissektion der Hypophysen bis die Zellen in der Schale überzogen sind. Nach einiger Übung Hypophyse Dissektion dauert ca. 2 – 3 min. pro Fisch, von denen nur rund 10 s sind notwendig, um die Hypophyse zu holen, wenn das Gehirn bereits ausgesetzt ist.</li>
	<li>Drehen Sie sorgfältig das Gehirn in Richtung der Mündung zu entlarven die Hypophyse und mit sauberen Pinzette mit einer geraden Spitze zu sezieren. Die Hypophyse auf ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL geändert dPBS übertragen (für Details, siehe Schritt 2.3) auf Eis gelegt. Überprüfen Sie die Spitze der Zange unter die Lupe genommen, um sicherzustellen, dass die Hypophyse erfolgreich, um das Rohr hinzugefügt wird und nichts auf der Zange bleibt. Hinweis: Sezieren Sie soviele Hypophysen Bedarf, abhängig von der Anzahl der Kultur Gerichte, die gleichzeitig zubereitet werden. Als Faustregel gilt berechnen Sie mindestens 10 Hypophysen von ausgewachsenen Fischen pro Schale, eine entsprechende Dichte der Zellen (die von der nachgeschalteten Anwendung abhängt).</li>
	<li>Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Sorgfältig die dPBS mit einer Glaspipette zu entfernen und um zu vermeiden, entfernen alle Hypophysen kümmern.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Trypsin-Lösung (in Schritt 1.4 vorbereitet) zu waschen die Hypophysen, drehen sie sich in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s und der Großteil der Flüssigkeit mit einer Glaspipette vor dem Hinzufügen einer zusätzlichen 1 mL Trypsin-Lösung zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr in einem Wasserbad bei 26 ° C für 30 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit.</li>
	<li>Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen an der Unterseite des Rohres befinden. Entfernen Sie die meisten der Trypsin-Lösung mit einer Glaspipette und 1 mL der Trypsin-Inhibitor-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.5) um die Trypsin zu inaktivieren und waschen die Hypophysen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Hypophysen an der Unterseite des Rohres durch Drehen sie nach unten in eine Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit mit einer Glaspipette und 1 mL die Trypsin-Inhibitor-Lösung (in Schritt 1.5 vorbereitet). Legen Sie das Rohr auf einem Wasserbad bei 26 ° C für 20 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit, die Trypsin zu inaktivieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 35 mm-Poly-d-Lysin-beschichtete Zelle Kulturschale mit einem zentralen Glasboden durch Hinzufügen von 2 mL des L-15 Mediums und lassen, dass für mindestens 10 min bei 26 ° C und mit 1 % CO2 zu Bebrüten, so dass es die richtige Temperatur und pH-Wert erreichen kann, vor der galvanischen Zellen. Hinweis: Die Kulturschale Kunststoff Zelle kann auch verwendet werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer Gerichts mit einem zentralisierten Glasboden ist, dass der Bereich, wo die Zellen überzogen sind, kleiner, und daher weniger Hypophyse Zellen pro Gericht erforderlich sind. Einige downstream-Anwendungen erfordern möglicherweise auch ein Glasboden (d.h., einige bildgebenden Verfahren).</li>
	<li>Die kühle Zentrifuge für die 15 mL-Tuben bis 4 ° C erlauben es, die gewünschte Temperatur zu erreichen, bevor Sie beginnen die mechanische Dissoziation festgelegt.</li>
	<li>Sammeln die Hypophysen am unteren Ende der Röhre durch Drehen hinunter den Schlauch mit Trypsin Inhibitor Lösung (aus Schritt 3.11) in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen befinden sich am Boden des Röhrchens vor sorgfältig entfernen die meisten der Trypsin-Inhibitor-Lösung mit einer Glaspipette. Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte des Protokolls in einer Laminar-Flow Bank (LAF) zertifiziert für Zelle Arbeit um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Die Hypophyse Gewebe Stücke 1 mL eiskaltes modifizierte dPBS (vorbereitet in Schritt 2.4) hinzu und saugen Sie sanft die Gewebe Stücke nach oben und unten (6 – 7 X) in eine feuerpolierte Glaspipette (in Schritt 2.1 vorbereitet). Hinweis: Die Temperatur ist ein wichtiger Aspekt, also halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C. Ab diesem Zeitpunkt alle Schritte auf dem Eis wenn möglich.</li>
	<li>Spin-down der Gewebe-Stücke in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und übertragen Sie sorgfältig am oberen Ende des dPBS der dissoziierten Zellen (fast 1 mL), eine neue 15 mL Tube auf Eis gelegt. Vermeiden Sie die Pipette in Richtung zur Unterseite des Rohrs bewegen, wo sind die Gewebe Stücke übrig.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.16 – 3.17, wehre die Zellen in 1 mL eiskaltes dPBS hintereinander, bis alle 10 mL des dPBS verwendet wird. Starten Sie mit einer Glaspipette mit einem mittleren Öffnung und Umstellung auf eine Glaspipette mit einer kleineren Öffnung gegen Ende (für die letzten 3 – 4 mL des dPBS hinzugefügt) die Dissoziation. Wenn es noch sichtbare Gewebe Stücke am Ende des Verfahrens Dissoziation, pipettieren, ca. 10 X auf die 2 letzten Schritte des dPBS zur Dissoziation zu erhöhen, und schließlich die verbleibende Gewebe Stücke hinterlassen. Aufschwemmen der Zellen vorsichtig und vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen, als es Zellschäden verursachen, wenn die Zellen an der Oberfläche der Blasen befestigen. Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt dieses Protokolls und erfordert einige Übung, ein gutes Ergebnis zu erreichen.</li>
	<li>Balancieren Sie das Rohr in die Zentrifuge (vorgekühlt auf 4 ° C) und Spin-down der Zellen bei 200 X g für 10 min bei 4 ° C. Achten Sie auf die Seite des Rohres zu markieren, wo die Zelle Pellet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Schlauch aus der Zentrifuge und übertragen Sie den Überstand mit einer Glaspipette sanft auf eine leere 15 mL-Kunststoff-Rohr direkt nach der Zentrifugation. Achten Sie darauf, entfernen die meisten des Überstands aber achten Sie darauf, nicht zu verlieren die kleinen Pellets (oft unsichtbar) Zelle.</li>
	<li>Sorgfältig Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50-100 µL L-15 Kulturmedium. Hinweis: Bei diesem Schritt ist es möglich, zählen die Zellen und/oder führen Sie einen Test der Lebensfähigkeit (z. B. eine Zelle zählen im Beisein von Trypan blau mit einem Hemocytometer), aber hüten Sie sich vor, dass mit einem Teil der Zellsuspension zu diesem Zweck die Ausbeute senken. Vermeiden Sie die Verwendung einer großen Aussetzung Volumen da es das Risiko einer Verbreitung außerhalb der Mitte der Schale Zellen erhöht wird.</li>
	<li>Sorgfältig abtropfen der dissoziierten Zellen in der Mitte der Zelle Kulturschale mit 2 mL des L-15 Mediums (vorbereitet in Schritt 3.13). Lassen Sie die Zellen an der Unterseite der Schale für ca. 5 min zu versenken, bevor Sie verschieben sie in den Inkubator zu vermeiden, dass die Zellen außerhalb der versunkenen Teil der Glasboden zu verbreiten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schüssel bei 26 ° C und 1 % CO2 erlauben die Zellen gründlich zu versenken und legen auf den Boden der Schale.</li>
	<li>Schauen Sie nach 30 min sich die Zellen im Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie an der Kulturschale angeschlossen haben.</li>
	<li>Weiterhin die Zellen bei 26 ° C und 1 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Sorgfältig zu ändern die meisten (aber nicht alle) das Medium alle 3 – 4 Tage. Hinweis: Vermeiden Sie Ändern des Mediums immer häufiger, wie es möglicherweise die Zellen stören und machen sie von der Glasboden zu lösen. Verwenden Sie die Zellen innerhalb einer Woche nach der Aussaat sie für Experimente.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verzollen.

In-vitro- Zellkultursysteme bieten leistungsstarke Tools für Forscher, eine Fülle von verschiedenen biologischen Fragen zu beantworten, wenn im richtigen Weg1verwendet. Es ist wichtig zu bedenken, dass dissoziierte Zellen, die ihre Verbindungen zu den benachbarten Zellen verloren haben unterschiedliche funktionale Eigenschaften erhalten haben können, als sie in Vivo ursprünglich. Um zu vermeiden, wird auf die Gefahr hin falsch interpretiert, die Ergebnisse von in-vitro-</...

Zellkultur ist eines der wichtigsten Instrumente für die molekularbiologische Forschung, bietet eine ausgezeichnete Modellsystem für verschiedene biologische Fragen von normalen zellulären Physiologie bis hin zu Drogen-Screening und in der Karzinogenese1. Primärzellen, direkt aus dem tierischen Gewebe mit enzymatischen und/oder mechanischen Methoden isoliert werden oft als mehr biologisch relevante als Zell-Linien wie die biologische Reaktion auf die in-Vivo -Situation näher sein kann. Protokolle für die Zubereitung von primären Zellkulturen sollten optimiert werden, für jede Spezies und Zelle Interesse um imitieren die Eigenschaften, die eine Zelle angepasst ist, und physiologisch sinnvolle Ergebnisse zu erzielen.
Zahlreiche Protokolle beschreiben Kulturbedingungen für Säugetier-Zelle Systeme, während ähnliche Protokolle beschreiben Primärkultur Bedingungen für Fisch-Zellen im Vergleich eher knapp sind. Zellen sind anfällig für schnelle Änderungen in Temperatur, pH-Wert und Osmolalität und sind besonders empfindlich bei der Dissoziation. Kommerzielle Salzlösungen und Kulturmedien verwendet für Säugetier-Zelle Kulturen sind nicht optimal für teleost Fische, vor allem in Bezug auf die pH-Puffer-Systeme und Osmolalität. Deshalb ist es wichtig, zu messen und passen die Lösungen an physiologisch relevanten Ebenen dieser Parameter in den Arten von Interesse.
Hypophyse Primärkulturen von mehreren teleost Fischarten, darunter Karpfen vorgenommen wurden (Cyprinus Carpio)2,3, Rasen Karpfen (Ctenopharyngodon Idella)4, Goldfisch (Carassius Auratus )5, Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss)6, Europäischer Aal (Anguilla Anguilla)7, Tilapia (Oreochromis Mossambicus)8, Zebrafisch (Danio Rerio)9, und Atlantischer Kabeljau (Gadus Morrhua)10. Neben der Anpassung der Inkubationstemperatur auf die Arten von Interesse, haben einige dieser Protokolle der Zellen bei Säugetier-ähnlichen Bedingungen inkubiert, die möglicherweise für die Arten von Interesse, mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,5 in eine feuchte Atmosphäre suboptimale mit 3-5 % CO2. Darüber hinaus ist es unklar, ob die Osmolalität von Lösungen für die Zubereitung verschiedener diese primären Zellkulturen angepasst wurden und zwischen verschiedenen Lösungen stabil.
Das aktuelle Protokoll basiert auf früheren Arbeiten mit Primärkulturen von Atlantischer Kabeljau10 und besteht aus Anpassungen der Inkubationstemperatur, Osmolalität, pH-Wert und pH-Puffer-Systeme, einschließlich der Partialdruck des Kohlendioxids (pCO2), um die Physiologie des Medaka (O. Latipes). Medaka ist ein klein (3 – 4 cm) Süßwasserfisch, ursprünglich aus Ostasien. Heutzutage dient es als ein Modell-Arten in vielen Forschungslabors auf der ganzen Welt, da es relativ einfach zu züchten und sehr widerstandsfähig gegen viele gemeinsame Fisch Krankheiten11ist. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von Medaka als Vorbild, darunter eine Temperatur-Toleranz von 4 – 40 ° C11, eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen, ein Geschlecht-Bestimmung gen12, und eine sequenzierte Genom13, sowie viele andere verfügbaren genetischen Ressourcen.
Die primäre Kulturbedingungen in diesem Protokoll werden optimiert, entsprechend der Temperatur von 26 ° C, die Medakas in der Fisch-Anlage gehalten werden. Darüber hinaus die Osmolalität von 320 mOsm/kg aus Atlantischer Kabeljau in Salzwasser bis 290 mOsm/kg für Medaka Leben im Süßwasser lebenden reduziert und steht im Einklang mit der normalen Osmolalität von Medaka Plasma14. Im Vergleich dazu ist die typische Osmolalität von Säugetieren Plasma im Bereich von 275-295 mOsm15. Fische leben in einer Vielzahl von Temperaturen und haben Kiemen, die in direktem Kontakt mit Wasser, so dass der pH und Puffer Kapazität des Blutes und der extrazellulären Flüssigkeit in den Fischen unterscheiden sich von denen bei Säugetieren sind. Säugetier-Kultur Medien umfassen in der Regel Puffersysteme, die einen pH-Wert von etwa 7,4 führen, wenn die Medien sind zu einem standard-Atmosphäre von 5 % CO2 in befeuchtete Luft bei 37 ° c equilibriert Der pH-Wert ist temperaturabhängig und der Wert für pH-neutral (im Wasser) steigt mit abnehmender Temperatur16. Typische teleost Fische Plasma pH-Bereiche von 7,7 bis 7,917. Die Optimierung dieses Protokolls enthalten eine Reduzierung von pH 7,85 für Kabeljau auf pH 7,75 für Medaka auf 26 ° C gehalten, durch die Erhöhung der CO2 von 0,5 % bis 1 % bei 12 ° C gehalten.
Darüber hinaus unterscheidet sich die Bicarbonat-Pufferkapazität in Fischen und Säugetieren. CO2 ist leicht über die Kiemen bei Fischen ausgetauscht und die pCO2 im Wasser ist nur ein kleiner Bruchteil des pCO2 in der Lunge-18. Entweder die Temperatur oder die pCO2 ändert pH und Puffer des Mediums ändern. Weder den pH-Wert noch die pCO2 empfohlen für die Inkubation von Säugerzellen deshalb optimal für Fisch-Zellen, und daher sollte die Nährmedien mit Puffersysteme, die physiologisch relevanten Werte für Fische optimiert werden und die bestimmte Arten von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die primären Zellkulturen von Medaka Hypophysen vorzubereiten und umfassen Anpassungen der Inkubation Osmolalität, Temperatur, pH-Wert und pH Puffersystem, neben anderen wichtigen Parameter, die bei der Vorbereitung der Primärzelle Kulturen von nicht-Säugetier-Arten.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D8537</td><td>Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.</td></tr><tr><td>L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>L5520</td><td>Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 &amp;micro;m PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5881</td><td>Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>S5761</td><td>10 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; equals 420 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>63565</td><td>Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>G5400</td><td>4.5 mM&amp;nbsp; D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)</td><td>35050-061</td><td>Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>P0781</td><td>Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 &amp;micro;g/mL Streptomycin).</td></tr><tr><td>Trypsin type II-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T7409</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution.</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>T6522</td><td>Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 &amp;micro;g/ml Dnase I (see details below).</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma (Merck, Damstadt, Germany)</td><td>D5025</td><td>Use in trypsin inhibitor solution (see above).</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m Polyethersulfone (PES) sterile filter system</td><td>Corning Inc. (Corning, NY)</td><td>431097</td><td>Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.</td></tr><tr><td>35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.</td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11254-20</td><td>Straight tip</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 fine forceps</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>11253-25</td><td>Angled 45&amp;deg; tip</td></tr><tr><td>Stereo microscope SZ61</td><td>Olympus Corp. (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>Use for dissection of pituitaries.</td></tr><tr><td>Alegra X-22R Centrufuge</td><td>Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)</td><td></td><td>With cooling option (similar to current model XR-30).</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Techne (Staffordshire, UK)</td><td></td><td>Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.</td></tr><tr><td>Pasteur glass pipettes</td><td>VWR (NY)</td><td>612-1701</td><td>Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.</td></tr><tr><td>Galaxy MiniStar table centrifuge</td><td>VWR (NY)</td><td>521-2844</td><td>Any small table centrigue will do.</td></tr><tr><td>Fine needles/insect pins</td><td>Fine Science Tools (CA)</td><td>26001-40</td><td>Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.</td></tr><tr><td>Wax plate</td><td></td><td></td><td>Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.</td></tr></tbody></table>

preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries

Primärzelle Kultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig von Wissenschaftlern verwendet, um zellulare Eigenschaften und Mechanismen der isolierten Zellen in einer kontrollierten Umgebung zu studieren. Trotz der großen Unterschiede in der Physiologie zwischen Säugetieren und Fischen Primärzelle Kultur Protokolle von den Fischen oft Säugetier-Kulturbedingungen, oft mit nur geringfügigen Änderungen basieren. Die ökologischen Unterschiede beeinflussen nicht nur die Körpertemperatur, sondern auch Blutserum Parameter wie Osmolalität, pH-Wert und Pufferkapazität pH. Da Zellkulturmedien und ähnlich funktionierende Lösungen imitieren Merkmale der extrazellulären Flüssigkeit bzw. Blutserum sollen, bei denen eine Zelle angepasst ist, ist es wichtig, dass diese Parameter speziell auf das betreffende Tier angepasst werden.
Das aktuelle Protokoll beschreibt optimierte Primärkultur Bedingungen für Medaka (Oryzias Latipes). Das Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie zu isolieren und halten gesund dissoziiert Hypophyse Zellen für mehr als eine Woche und umfasst folgende Schritte: 1. gefunden die Einstellung der Osmolalität auf die Werte im Blutplasma Medaka, 2. die Anpassung der Inkubationstemperatur auf normalen Medaka Temperatur (hier in der Aquarium-Anlage), und 3. die Einstellung des pH und Bicarbonat Puffer zu Werten vergleichbar mit anderen Fischarten Leben bei ähnlichen Temperaturen. Die Ergebnisse, die mit dem beschriebenen Protokoll physiologisch sinnvolle Ergebnisse für Medaka fördern und von Wissenschaftlern machen primären Zellkulturen von anderen nicht-Säugetier-Arten als Nachschlagewerk verwendet werden können.

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung einer Primärzelle Kultur von Medaka Hypophysen und bietet gesunde Zellen, die in einer Kultur für mindestens eine Woche gewartet werden können. Das Protokoll basiert auf physiologisch relevanten Werte für Medaka14 und ist zusätzlich mit der Hypophyse Gewebe im ausgewachsenen Fischen, mit einem pH-Wert von 7,75 und eine Osmolalität von 290 mOsm/kg während des gesamten Verfahrens von der Gewebe-Ernte, die vergoldete...

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Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.

Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Aufrufe.  Norwegian University of Life Sciences. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.

Serie: Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Biologie

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Medizin

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the clear majority have been performed on dissociated primary cells. To improve our understanding of how teleost pituitary cells, behave in a more biologically relevant environment, this protocol shows how to prepare viable brain-pituitary slices using the small freshwater fish medaka (Oryzias latipes). Making the brain-pituitary slices, pH and osmolality of all solutions were adjusted to values found in body fluids of freshwater fish living at 25 to 28 &#176;C. Following slice preparation, the protocol demonstrates how to conduct electrophysiological recordings using the perforated whole-cell patch-clamp technique. The patch-clamp technique is a powerful tool with unprecedented temporal resolution and sensitivity, allowing investigation of electrical properties from intact whole cells down to single ion channels. Perforated patch is unique in that it keeps the intracellular environment intact preventing regulatory elements in the cytosol from being diluted by the patch pipette electrode solution. In contrast, when performing traditional whole-cell recordings, it was observed that medaka pituitary cells quickly lose their ability to fire action potentials. Among the various perforation techniques available, this protocol demonstrates how to achieve perforation of the patched membrane using the fungicide Amphotericin B.

The article describes an optimized protocol for making viable brain-pituitary tissue slices, using the teleost fish medaka (Oryzias latipes), followed by electrophysiological recordings of pituitary cells using the patch-clamp technique with the perforated patch configuration.

Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Neurowissenschaften

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

Einzelzell-Suspensionspräparat aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Generation of Primary Retinal Ganglion Cell Cultures From Zebrafish Embryos

Source: Terzi, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/62165">ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing primary retinal ganglion cells from zebrafish embryos. Early-stage embryos undergo dissection to isolate the eyes, which are subsequently mechanically dissociated into a suspension of retinal ganglion cells. This cell suspension is cultured on coverslips coated with adhesive proteins to facilitate axon development.

Erzeugung von primären retinalen Ganglienzellkulturen aus Zebrafischembryonen

1. Preparation of solutions

	E2 media (1x)
	
		Prepare 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) and 500x E2C (100 mL) solutions by combining all components ...