O objetivo geral do protocolo é gerar um modelo de camundongo humanizado com sistema imunológico humano funcional e fígado usando células-tronco hematopoiéticas humanas e sítio hepato. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave em camundongos humanizados do fígado genético. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar a imunopatologia causada pelo HIV, como observado nas pessoas.
A demonstração do processo será de Yimin Sun, supervisor do departamento de patologia e microbiologia, juntamente com Weimin Wang e Edwrd Makarov, tecnólogo de pesquisa. Para começar, transfira o sangue do cordão umbilical coletado em tubos heparinizados para um armário de fluxo laminar estéril. Adicione PBS até que o volume seja aumentado para 35 mililitros.
Coloque a amostra em cima do meio de separação do linfócito e centrífuga 400 vezes G e a quatro graus celsius por 35 minutos sem quebras. Em seguida, remova cuidadosamente a camada de plasma superior e use uma pipeta de transferência para transferir a interface do casaco branco para um novo tubo. Suspenda o casaco de polimento em 30 a 40 mililitros de tampão gelado.
Usando uma pipeta, combine 20 microliters da suspensão celular com 20 microliters de 0,4% de tripano azul. Pipeta 10 microliters desta mistura na abertura externa de qualquer uma das duas câmaras de um slide de contagem, e inserir o slide em um contador automatizado de células para contar as células. Centrifugar as células a 300 vezes G e a 4 graus celsius por 10 minutos.
Aspire cuidadosamente o supernascer e adicione 300 microliters de tampão frio de gelo. Adicione 100 microliters de reagente de bloqueio de receptor FC humano e 100 microliters de anticorpos anti-humanos cd34 conjugados de camundongos monoclonais microesferas para até 100 milhões de células. Incubar por 30 minutos a quatro graus celsius.
Adicione 10 mililitros de tampão gelado para lavar as células e centrífugas 300 vezes G e quatro graus celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente o supernascer e suspenda a pelota em 500 microliters de tampão gelado. Depois disso, coloque uma coluna LS de seleção positiva no campo de triagem celular ativada magnética e passe-a com três mililitros de tampão gelado.
Carregue a amostra na coluna LS que pode prender microesferas ligadas a células positivas CD34 humanas em amostras, e permitir que ela flua sob a influência da gravidade para o tubo de coleta. Lave a coluna três vezes com tampão gelado e colete o eluent no mesmo tubo de coleta. Em seguida, mergulhe a coluna com cinco mililitros de tampão gelado para aludir as células positivas cd34 em um novo tubo de coleta.
Repita o procedimento para alcançar uma pureza de mais de 90%, use corante azul trypan e um hemócitometro para contar as células positivas CD34 iludidas. Após a contagem, centrifugar as células a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernascer e suspenda as células em 125 microliters de PBS para uma injeção a ser usada imediatamente no transplante.
Para verificar a pureza do eluente positivo CD34, pegue 50 microliters da suspensão e incuba-o com 10 microliters de anticorpo CD34 conjugado de PE a quatro graus celsius por 30 minutos. Depois disso, lave e suspenda as células em PBS e prossiga para realizar a citometria de fluxo. Após a aquisição, analise os dados conforme descrito no protocolo de texto.
Primeiro, recuperar e descongelar os hepatócitos criopreservados, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, remova a tampa biológica e despeje os hepatócitos descongelados em um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio de descongelamento aquecido. Balance o tubo à mão por alguns segundos para suspender as células.
Pelota as células a 100 vezes G e à temperatura ambiente por oito minutos. Lave as células pelleted em PBS com 0,1%BSA e lavonha-as com HSPCs frescos ou descongelados em PBS a um volume final de 80 microliters por mouse. Primeiro, conecte uma extremidade de um tubo de extensão estéril a uma agulha calibre 30 e a outra extremidade a uma seringa de um mililitro.
Encha a seringa com a suspensão de HEPs agrupados e HSPCs. Coloque a seringa no entalhe de uma pipeta de distribuição repetitiva e ajuste o dispensador para dispensar 10 microliters em cada prensa. Raspe cada rato como descrito no protocolo de texto e esfregue o lado esquerdo do corpo de cada rato com iodo de 10% povidone seguido de álcool isopropílico de 70%.
Utilizando tesouras do tipo Vannas, faça uma pequena incisão na pele, músculo e peritônio à esquerda da parede peritônio para entrar na cavidade peritoneal aproximadamente 5 milímetros abaixo da borda inferior da caixa torácica. Localize o baço e use fórceps para puxá-lo ligeiramente para a área de operação para fácil acesso e inserir a agulha de calibre 30 no polo inferior do baço. Em seguida, desbloqueie o êmbolo da pipeta de distribuição e dispense 10 microliters do volume por vez, com um limite de 60 a 80 microliters por baço.
Retraia a agulha lentamente e corte o baço com clipes ligantes usando um aplicador de ligadura. Em seguida, use aplicadores de ponta de algodão molhados com PBS estéril para empurrar o baço de volta para a cavidade corporal. Use um padrão de sutura interrompido para fechar a camada muscular da parede abdominal.
Realize o fechamento da pele com um padrão de sutura interrompido usando suturas não absorvíveis. Transfira todos os materiais necessários para uma instalação designada para o Nível Dois Plus. Use equipamentos de proteção pessoal, incluindo uma capa descartável de todos os vestidos, capas de sapato, uma máscara facial e luvas duplas, incluindo luvas resistentes a cortes, em todos os momentos enquanto trabalha com o vírus.
Selecione camundongos com uma reconstituição de mais de 15% das células positivas de CD45 humanos e com presença de albumina humana no soro para infecção pelo HIV-1. Injete intraperitoneally os camundongos com doses infecciosas de 1.000 a 10.000 de cultura tecidual de 50 HIV-1 ADA em um volume de 100 a 200 microliters por rato. Depois de eutanásia dos camundongos, extiria o fígado de cada rato como descrito no protocolo de texto.
Coletar e fixar os fígados em 4% de paraformaldeído durante a noite. O estabelecimento de um modelo de camundongo humanizado duplo com fígado humano e células imunes pode ser facilmente monitorado a cada passo com ELIZA muito simples e citometria de fluxo, respectivamente. A citometria de fluxo é realizada regularmente para avaliar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional e para ver o efeito da infecção pelo HIV nas células imunes.
Em camundongos humanizados duplos, o desenvolvimento de células imunes funcionais pode variar de 15 a 90% do portão linfócito. Para a avaliação do engrafamento dos hepatócitos humanos, eliza para níveis de albumina específicos humanos é realizada mensalmente no soro do rato. Camundongos engrafados com HSPCs e HEPs mostram níveis de albumina específicos do homem que variam de aproximadamente sete microgramas por mililitro a 377 microgramas por mililitro em um mês, continuando a crescer ao longo do tempo de observação.
O efeito da infecção pelo HIV em células imunes humanas no sangue de camundongos humanizados duplos é monitorado pela citometria de fluxo e nos HEPs no fígado pela albumina específica humana ELIZA. Em cinco semanas, o HIV-1 causa uma diminuição nos níveis de albumina humana no soro e há um esgotamento dos hepatócitos positivos ck18 humanos nas seções hepáticas de camundongos humanizados duplos. Uma menor proporção de CD4 para CD8 é tipicamente observada no sangue e fígado de camundongos infectados pelo HIV, em comparação com os níveis observados no mesmo camundongo antes da infecção.
O sangue deve ser colocado cuidadosamente em cima do meio de separação do linfócito para isolamentos de casaco buffy. Para a cirurgia, segure o baço suavemente e insira a agulha no polo inferior do baço. Após o isolamento de células-tronco hematopoiéticas, é crucial verificar a pureza das células-tronco hematopoiéticas positivas cd34 para evitar células positivas CD3 e injeções agudas de hepatócito de diferentes doadores.
Como os camundongos humanizados mostram aspecto fisiológico do sistema imunológico humano e do fígado, os camundongos desenvolvidos poderiam ser utilizados para estudar a fisiopatênese do HIV e infecções físicas e cirrose.
