Usando ratos, este protocolo pode ser usado para estabelecer um novo modelo de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico. com ratos, o estabelecimento do modelo de infecção do EcoHIV para estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos pode ser benéfico para o estudo de distúrbios neurológicos e neurocognitivos associados ao HIV-1. O procedimento de demonstração será Hailong Li, um pesquisador associado do meu laboratório.
Para a embalagem do vírus em 293 células T, semente cinco vezes 10 para a quinta 293 células T por mililitro de DMEM complementado com 10% FBS em cada um dos dois frascos de 75 centímetros quadrados revestidos de gelatina e incubar as células a 37 graus Celsius até que as culturas atinjam 50% de confluência. No dia da transfecção, diluir 22,5 microliters de reagente de transfecção em 750 microliters de frasco médio por frasco em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e vórtice da solução por três segundos. Diluir 20 microgramas do DNA plasmídeo quimérico EcoHIV em 750 microlitres de meio em um segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por frasco com mistura completa.
Combine o DNA diluído com o reagente de transfecção diluído com mistura suave e incubar a solução resultante por 15 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione cada suspensão do vírus a 10 mililitros de meio DMEM pré-guerra e adicione cada solução suplementada por vírus a um frasco de 293 células T. Após dois dias de cultura celular, acumule o supernacido dos frascos em um único tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e transfira o supernante esclarecido para um novo tubo de 50 mililitros.
Adicione oito mililitros de Concentredor Lenti-X ao supernanato esclarecido e misture com inversão suave. Após uma incubação de dois dias a quatro graus Celsius, centrifugar a mistura e remover cuidadosamente o supernascer, em seguida, resuspenque suavemente a pelota com 100 microliters de 100 milmolarES PBS e use um kit P24 ELISA para titer a concentração do vírus. Para a injeção EcoHIV-EGFP, após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, raspe os cabelos da região cerebral e esterilize a pele exposta duas vezes com 70% de etanol e um esfoliante à base de clorexidina.
Fixar o rato em uma posição propensa em um aparelho estereotaxic e fazer uma incisão de cinco a seis centímetros através da pele ao longo da linha média do couro cabeludo. Marque uma posição de perfuração a 0,8 milímetros lateral e uma rostral de 1,2 milímetros para bregma e fure um buraco de 0,4 milímetros de diâmetro em cada posição do crânio. Carregue 1,04 vezes 10 para a sexta unidade de transdução por mililitro da solução de lentivírus EcoHIV em uma seringa de injeção de 10 microliteres e fixe a seringa no aparelho estereotaxico.
Mova a agulha perto da superfície de um orifício de perfuração e insira a agulha 2,5 mililitros no orifício. Infundir um microliter de solução de vírus a uma taxa de 0,2 microliters de vírus por minuto. Quando todo o vírus tiver sido injetado, deixe a agulha dentro da área de injeção por cinco minutos antes de retirar lentamente a agulha até que ela esteja fora do crânio do rato.
Feche a incisão da pele com uma sutura de fio de seda 4-0 e esterilize a solução com 70% de etanol, em seguida, coloque o rato em uma câmara de recuperação com uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência. Uma a oito semanas após a infusão viral, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, fixar o rato em uma posição supina dentro de um capô de fumaça e incisar a pele ao longo da linha média torácica. Corte o diafragma para abrir a cavidade torácica e insira uma agulha de 20 por 25 milímetros no ventrículo esquerdo.
Abra imediatamente o átrio direito com tesouras e perfunda 50 mililitros de PBS de 100 mililitros pré-refrigerados a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto. Quando todo o PBS for entregue, perfuse com 100 mililitros de frio 4%paraformaldeído. Quando todo o fixador tiver sido entregue, remova o cérebro do crânio e fixe o tecido durante a noite em um fresco 4% de desidida.
Na manhã seguinte, coloque a amostra em 40 mililitros de 30% de sacarose em 100 mililitros pbs em um tubo de 50 mililitros por cerca de três dias até que o cérebro se instale no fundo do tubo antes de estalar o tecido cerebral em butanol metil por dois minutos a menos 80 graus Celsius. Após o congelamento, use um criostat de menos 20 graus Celsius e um pincel fino para adquirir seções coronais de 50 mícrons de espessura. Quando todas as seções tiverem sido obtidas, cubra as amostras com 300 microliters de meio anti-fade e monte-as com 22 tampas de 50 mililitros.
Quando o meio secar, imagem as seções por microscopia confocal. Sete dias após a injeção de Lentivírus, imagens de fatias cerebrais coronal de ratos revelam uma presença significativa de sinais EcoHIV-EGFP em todo o tecido cerebral, especialmente dentro do córtex e do giro dentonato hipocampal. A rotulagem dupla com e as sondas Iba1 e EcoHIV-EGFP fornecem fortes evidências de que a microglia é o tipo de célula predominante que abriga a expressão EcoHIV no cérebro.
Oito semanas após a infecção, os animais injetados pelo EcoHIV apresentam uma relativa insensibilidade à manipulação do intervalo interestimuloso, como evidenciado por uma função de intervalo relativamente mais plana em comparação com os controles salinos. Além disso, os ratos injetados pelo EcoHIV apresentam alterações profundas em sua morfologia dendrítica da coluna vertebral, como evidenciado por uma frequência relativa aumentada de espinhos dendráticos mais curtos com aumento dos diâmetros da cabeça e pescoço em relação aos animais de controle. A concentração e titulação do meio da condição antes da injeção estereotaxica é fundamental para garantir os resultados consistentes e replicáveis em experimentos.
Esta injeção estereotaxa regional específica do EcoHIV fornece uma infecção eficiente pelo HIV dentro do cérebro e produz déficits de processamento temporal em ratos. A utilização de injeções estereotaxas de HIV em ratos para estender o modelo de infecção pelo EcoHIV oferece uma oportunidade fundamental para abordar novas questões relacionadas ao neuro HIV em questão.
