Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o ciclismo biogeoquímico de cádmio e mercúrio, como como diferentes variáveis ambientais afetam sua biodisponibilidade às bactérias. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece dados de biodisponibilidade em tempo real e células viáveis, independentemente da presença de oxigênio. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque há muitas etapas sensíveis ao tempo que requerem uma atenção muito meticulosa aos detalhes.
Demonstrando o procedimento será Ben, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para se preparar para o ensaio, recupere o biosensível indutível de mercúrio e o biosensível expresso constitutivamente a partir de um estoque crio de menos 80 graus Celsius. Coloque as células nas placas de caldo de Lysogeny contendo 120 microgramas por mililitro de ampicilina.
Cresça as culturas das placas em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. Entre 16:30 e 17:00.m. inocular uma cultura em dez mililitros de LB com ampicillina e crescer durante a noite a 37 graus Celsius com tremor a 220 rpm.
Entre nove e dez a.m. na manhã seguinte trazem a cultura, bem como o meio de crescimento previamente preparado para a câmara anaeróbica. Em seguida, adicione oito mililitros de médio de crescimento fresco e 210 microgramas por mililitro de ampicillina em um tubo de balch estéril.
Agora colete dois mililitros da cultura cultivada durante a noite e transfira para um tubo de micro centrífuga de dois mililitros. Depois de centrifugar a 10.000 RCF por 90 segundos, remova o supernasce e resuspend em dois mililitros de meio de crescimento fresco. Em seguida, adicione a cultura resuspended ao tubo de varanda contendo oito mililitros de médio de crescimento fresco e ampicillina.
Usando técnica estéril, coloque cuidadosamente uma rolha de borracha no tubo de balch antes de removê-la da câmara anaeróbica. Em seguida, coloque o tubo em uma incubadora e cresça anaerobicamente a 37 graus Celsius com agitação a 220 rpm. Entre três e cinco p.m.
trazer o tubo de balch com a cultura, um novo tubo de balch estéril, e o meio de crescimento para a câmara anaeróbica. Adicione 100 microliters da cultura a 10 mililitros de meio de crescimento fresco com ampicillina no tubo de balch estéril. Usando técnica estéril, coloque cuidadosamente uma rolha de borracha no tubo de balch.
Remova o tubo da câmara anaeróbica antes de aurá-lo durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 220 rpm. Entre nove e dez a.m. no dia seguinte, transfira a cultura e o meio de crescimento de volta para a câmara anaeróbica.
Adicione novamente oito mililitros de meio de crescimento e ampicillina em um tubo de balch estéril. Transfira dois mililitros da cultura cultivada durante a noite em um tubo de micro centrífugas de dois mililitros. Após a centrifugação como antes, remova o sobrenaspeente e resuspense as células em dois mililitros de meio de crescimento fresco.
Em seguida, adicione a cultura resuspended ao tubo de balch contendo o meio de crescimento fresco e ampicillina. Usando técnica estéril, coloque cuidadosamente uma rolha de borracha no tubo de balch. Remova-o da câmara e cresça anaerobicamente a 37 graus Celsius com agitação a 220 rpm.
Monitore o crescimento da cultura usando um espectrofotômetro vórtice ao vórtice da cultura e, em seguida, medindo a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD600. Após três a quatro horas de crescimento esperado, a cultura deve atingir um OD600 de 6. Agora traga o tubo na câmara anaeróbica e transfira a cultura para dois tubos de micro centrífugas mililitros.
Seguindo a centrifugação como antes remover o supernasce e resuspendar cada paladar celular em dois mililitros de meio de exposição fresco. Repita esta etapa de lavagem uma vez para remover qualquer traço do meio de crescimento. Agora combine ambos os tubos de micro centrífuga da cultura celular em um frasco padrão PTFE de sete mililitros para obter o estoque biosensor para uso no ensaio de exposição.
Antes de iniciar o experimento verifique o monitor anaeróbico para garantir que não há oxigênio na câmara anaeróbica. Projete o layout da placa de acordo com um modelo de poço 96. Para executar experimentos em réplicas técnicas de três isso permitirá 32 tratamentos diferentes, que é melhor representado com uma grade de quatro por oito para configurar os frascos.
Configure a grade quatro por oito de acordo com o layout da placa de ensaio. Em seguida, coloque sete frascos padrão PTFE mililitros na bandeja. Frascos só devem ser manuseados manipulando o exterior do frasco.
Adicione o volume médio de exposição em cada frasco correspondente a cada tratamento. A cada frasco adicione o volume correspondente da variável química a ser testada de acordo com o layout da placa. Agora adicione nitrato a cada frasco para que a concentração seja de 200 micromolar.
Exclua esta etapa para o tratamento biosensível constitutivo em branco. Para adicionar mercúrio aos frascos, primeiro pegue o estoque de quatro a oito micromolares e agite bem. Diluir o meio de solução e exposição em um frasco ptfe de sete mililitros para uma concentração de 100 a 250 nanomolar para fazer uma solução de mercúrio funcionando.
A partir desta solução de trabalho, adicione mercúrio aos frascos necessários de acordo com o layout da placa. Depois de adicionar o mercúrio ou cádmio agitar manualmente a placa em um movimento orbital. O experimento pode ser pausado agora, dependendo do tempo necessário para mercúrio ou cádmio para especiar em solução.
Quando o experimento é retomado, gentilmente pipeta biosensor estoque para trás e para frente para garantir a homogeneidade. Em seguida, adicione 100 microliters do estoque biosensor a cada frasco e agite manualmente a placa como antes. Aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius e configure uma corrida cinética por dez horas com leituras a cada dois pontos de cinco a cinco minutos.
Um orbital tremendo entre as leituras. Configure a corrida para tomar medidas de fluorescência com uma excitação de fluorescência de 440 nanômetros e uma emissão de 500 nanômetros. Agora pipeta 200 microliters de cada frasco PTFE na grade quatro por oito para os poços correspondentes da placa de poço 96.
Pipeta para frente e para trás cinco vezes antes de transferir cada 200 microliters. Em vez de descartar a ponta da pipeta, deixe a ponta da pipeta no frasco ptfe para acompanhar o progresso da tubulação. Coloque a placa 96 bem na bandeja do leitor de placas.
Em seguida, coloque a tampa na placa 96 e comece o ensaio. Aqui estão os resultados representativos mostrando dados corrigidos de fluorescência em função do tempo. A fluorescência é mostrada com concentrações crescentes de mercúrio para o biosensor indutível.
Todos os valores estão em branco para o controle de mercúrio. Os picos fluorescentes podem ser quantificados para mostrar o sinal fluorescente em função da concentração de mercúrio ou cádmio. Tanto para os biosensores indutíveis quanto para os biosensores constitutivos, deve-se utilizar a concentração de mercúrio ou cádmio no meio da faixa linear dos sensores indutíveis.
Aqui estão exemplos de um resultado inconclusivo com zinco. E um resultado conclusivo com magnésio e manganês sobre biodisponibilidade de mercúrio para o biosensor. O resultado com zinco é inconclusivo porque a fluorescência constitutiva decai com fluorescência indutível indicando toxicidade.
Ao tentar este procedimento é importante lembrar-se de entrar nas concentrações de cádmio ou mercúrio, pois estes serão usados para calibrar o biosensor. Após este procedimento, outros métodos como a modelagem termodinâmica de sistemas aquosos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como espécies químicas específicas de mercúrio ou cádmio afetam sua biodisponibilidade. Não se esqueça que trabalhar com cádmio e mercúrio e ácidos fortes, como ácido sulfúrico, pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de microbiologia ambiental explorarem mercúrio anaeróbico quase em tempo real ou biodisponibilidade de cádmio e micróbios geneticamente tratáveis.
