이 방법은 다른 환경 변수가 박테리아에 그들의 생체 이용률에 어떻게 영향을 미치는지 와 같은 카드뮴과 수은의 생물지질화학 적 사이클링에 관한 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 산소의 존재에 관계없이 준 실시간 생체 이용률 데이터와 실행 가능한 세포를 제공한다는 것입니다. 일반적으로이 방법에 새로운 개인은 세부 사항에 매우 세심한주의를 필요로 하는 많은 시간 민감한 단계가 있기 때문에 투쟁 할 것이다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 졸업생 인 벤이 될 것입니다. 분석에 대비하기 위해 수은 유도 가능한 바이오 센서와 구성적으로 발현된 바이오센서를 영하 80도의 냉동저온 육수에서 회수합니다. 암피실린의 밀리리터 당 120 마이크로그램을 포함하는 리소게니 국물 판에 세포를 접시.
하룻밤 사이에 37도에서 인큐베이터에서 플레이트 배양을 성장시다. 4:30에서 5 p.m. 암피실린을 가진 LB의 10 밀리리터에 있는 문화를 접종하고 220 rpm에서 동요와 섭씨 37도에서 밤새 자랍니다.
다음날 아침 9~10시에.m. 그런 다음 신선한 성장 매체의 8 밀리리터와 멸균 발치 튜브에 암피실린의 밀리리터 당 210 마이크로 그램을 추가합니다.
이제 하룻밤 재배 문화의 두 밀리리터를 수집하고 2 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 전송합니다. 90초 동안 10, 000 RCF에서 원심분리한 후, 상체를 제거하고 2밀리리터의 신선 성장 배지로 재연합니다. 그런 다음 신선한 성장 배지와 암피실린의 8 밀리리터를 포함하는 발치 튜브에 재일시 된 문화를 추가합니다.
멸균 기술을 사용하여 혐기성 챔버에서 제거하기 전에 발치 튜브에 고무 스토퍼를 조심스럽게 배치하십시오. 그런 다음 튜브를 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 혐기성으로 성장하여 220 rpm에서 흔들어 놓습니다. 3에서 5 p.m 사이.
배양, 새로운 멸균 발치 튜브 및 성장 배지를 혐기성 챔버로 가져올 수 있습니다. 멸균 발치 튜브에 암피실린을 넣은 신선한 성장 배지 10밀리리터에 100마이크로리터의 배양을 추가합니다. 멸균 기술을 사용하여 발치 튜브에 고무 스토퍼를 조심스럽게 배치하십시오.
혐기성 챔버에서 튜브를 제거한 후 밤새 섭씨 37도에서 220 rpm에서 흔들리면 됩니다. 다음날 9~10시 .m. 문화와 성장 배지를 혐기성 챔버로 옮기다.
다시 멸균 발치 튜브에 성장 매체와 암피실린의 8 밀리리터를 추가합니다. 하룻밤 재배 문화의 2 밀리리터를 2 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기다. 이전과 같이 원심 분리에 따라, 상체를 제거하고 신선한 성장 매체의 두 밀리리터에서 세포를 다시 중단.
그런 다음 신선한 성장 배지 및 암피실린을 함유한 발치 튜브에 재일시 중단 된 배양을 추가합니다. 멸균 기술을 사용하여 발치 튜브에 고무 스토퍼를 조심스럽게 배치하십시오. 챔버에서 제거하고 220 rpm에서 흔들어 와 섭씨 37도에서 혐기성 성장.
배양을 소용돌이게 한 다음 600나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정하여 분광계를 사용하여 배양의 성장을 모니터링한다. 3~4시간의 예상 성장 후, 문화는 6의 OD600에 도달해야 합니다. 이제 혐기성 챔버에 튜브를 가져와 두 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 문화를 전송합니다.
상신포를 제거하고 신선한 노출 매체의 2 밀리리터에서 각 세포 입맛을 다시 중단하기 전에와 같이 원심 분리를 따르기. 성장 배지의 흔적을 제거하기 위해 이 세척 단계를 한 번 반복하십시오. 이제 세포 배양의 두 마이크로 원심 분리관을 7밀리리터 PTFE 표준 바이알에 결합하여 노출 분석에서 사용하기 위한 바이오센서 스톡을 얻을 수 있다.
실험을 시작하기 전에 혐기성 모니터를 확인하여 혐기성 챔버에 산소가 없는지 확인합니다. 96 웰 템플릿에 따라 플레이트 레이아웃을 디자인합니다. 3개의 기술 복제에서 실험을 실행하면 32개의 다른 치료법이 허용되며, 이는 바이알을 설정하는 데 4개의 그리드로 가장 잘 표현됩니다.
분석 플레이트 레이아웃에 따라 4-8 그리드를 설정합니다. 그런 다음 트레이에 7 밀리리터 PTFE 표준 바이알을 놓습니다. 바이알은 바이알의 외부를 조작하여처리해야 합니다.
각 치료에 해당하는 각 바이알에 노출 배지 볼륨을 추가합니다. 각 바이알에 플레이트 레이아웃에 따라 테스트할 화학 변수의 해당 부피를 추가합니다. 이제 각 유리병에 질산염을 추가하여 농도가 200 마이크로몰러되도록 합니다.
구성 바이오 센서 처리 공백에 대한 이 단계를 제외하십시오. 바이알에 수은을 추가하려면 먼저 4~8개의 마이크로몰러 스톡을 가지고 잘 흔들어 주세요. 용액 및 노출 배지를 7 밀리리터 PTFE 바이알에서 100~250 나노몰러 의 농도로 희석하여 작동 수은 용액을 만듭니다.
이 작업 솔루션에서 플레이트 레이아웃에 따라 필요한 바이알에 수은을 추가합니다. 수은 또는 카드뮴을 추가한 후 수동으로 궤도 모션으로 판을 흔들어 줍니다. 이 실험은 수은 또는 카드뮴이 용액에서 관전하는 데 필요한 시간에 따라 지금 일시 중지될 수 있다.
실험이 재개되면 균일성을 보장하기 위해 바이오 센서 를 앞뒤로 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 각 바이알에 바이오 센서 스톡 100 마이크로리터를 추가하고 이전과 같이 수동으로 플레이트를 흔들어 줍니다. 플레이트 판독기를 섭씨 37도로 데우고 2점마다 5~5분마다 읽기로 10시간 동안 운동 런을 설정합니다.
판독값 사이에 궤도흔들림. 440 나노미터의 형광 발아와 500 나노미터의 방출로 형광 측정을 수행하도록 실행을 설정합니다. 이제 파이펫 200 마이크로 리터각 PTFE 바이알에서 4 그리드에서 96 웰 플레이트의 해당 우물로.
파이펫은 각 200 마이크로리터를 전송하기 전에 5번 앞뒤로 전송합니다. 파이펫 팁을 버리는 대신, 파이펫 팁을 PTFE 유리병에 두어 파이펫팅 진행 상황을 추적합니다. 96 웰 플레이트를 플레이트 판독기의 트레이에 넣습니다.
그런 다음 뚜껑을 96 웰 플레이트에 놓고 분석서를 시작합니다. 다음은 수정된 형광 데이터를 시간의 함수로 보여주는 대표적인 결과입니다. 형광은 유도 가능한 바이오 센서에 수은의 농도가 증가하는 것으로 나타났다.
모든 값은 수은 제어가 없는 데 비어 있습니다. 형광 피크는 수은 또는 카드뮴 농도의 함수로서 형광 신호를 나타내기 위해 정량화 될 수 있습니다. 유도성 및 구성 바이오 센서 모두의 경우 유도 가능한 센서 선형 범위의 중간에 있는 수은 또는 카드뮴 농도가 변수 테스트에 사용되어야 합니다.
다음은 아연과 결정적인 결과의 예입니다. 그리고 생체 센서에 수은 생체 이용에 마그네슘과 망간과 결정적인 결과. 아연의 결과는 구성형 형광이 독성을 나타내는 유도성 형광으로 부패하기 때문에 결정적이지 않습니다.
이 절차를 시도하는 동안 이러한 바이오 센서를 보정하는 데 사용되는 것으로 카드뮴 이나 수은의 농도를 입력하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 수성 시스템의 열역학 모델링과 같은 다른 방법은 수은 또는 카드뮴의 특정 화학 종이 생체 이용률에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 카드뮴과 수은, 황산과 같은 강한 산과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.
개발 후이 기술은 환경 미생물학 분야의 연구원들이 준혐기성 수은 또는 카드뮴 생체 이용률 및 유전적 인 미생물을 탐구할 수있는 길을 열었습니다.
