Os autores gostariam de agradecer ao Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e da Sociedade Canadense do Câncer de financiamento da investigação do ciclo celular em seu laboratório. MJC é um receptor de uma bolsa de MD / PhD da CIHR. MJC e MA são membros do programa de treinamento CaRTT.

1. Rotulagem e fixação de células <ol><li> Adicionar 1 mL de Reagente Labeling Proliferação Celular (BrdU) por mL de meio de cultura celular (1-1000 diluição) 1 hora antes da colheita. O período de rotulagem pode precisar ser aumentado para mais lento células de crescimento. </li><li> Às células colheita, meio de cultura aspirado e lavar cuidadosamente com tampão fosfato salino (PBS). Repita o procedimento para remover completamente os traços de médio porte. </li><li> Lavar as culturas rapidamente uma terceira vez com PBS contendo EDTA 3mm e aspirar completamente. </li><li> Adicionar um pequeno volume de PBS contendo EDTA 3mm a cada prato, 0,5 mL de um prato 6 centímetros é o ideal. Incubar a 22 ° C por aproximadamente 5 minutos para separar as células. Transferir para um tubo cônico de 15 mL. </li><li> Células Centrifugar a 500 xg por 5 minutos para pellet, remover o sobrenadante e ressuspender completamente em 100 L de PBS. </li><li> Fix células adicionando 5 mL de EtOH 95%, gota a gota, enquanto vórtex. Nesta etapa, as células podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos ummês. </li></ol> 2. Desnaturação e coloração de BrdU e DNA <ol><li> Centrifugar a 500 xg células por 5 minutos para as células pellet e remover EtOH 95%. Ressuspender em 1 ml de HCl 2N e 0,5% Tx-100, acrescentando de forma gota sábios quando vórtex. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Centrífuga como antes na seção 2.1 e aspirar cuidadosamente o sobrenadante vez que as células formam um pellet muito solto nesta etapa. Delicadamente ressuspender em 1 ml de 0,1 M NAB 4 O 7 (pH 8,5) e incubados por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Células pelota como acima na seção 2.1 e ressuspender em 0,5 mL de solução de anticorpos (PBS contendo 1% de BSA e 0,2% Tween-20) com o mouse anti-BrdU anticorpos diluídos 1-50. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. </li><li> Células de pelotas de novo e ressuspender em 50 mL de solução contendo anticorpo de coelho anti-rato anticorpos secundários conjugados com FITC diluído 1 a 25. Incubar por 30 minutos embancada e proteger da luz. </li><li> Células centrífuga vez que uma final e ressuspender em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase (PI-RNAse solução PBS com BSA 1%, 10 mg / mL de iodeto de propídio, 0,25 mg / mL de RNase A) e incubar no escuro a 37 ° C por 30 minutos. Alternativamente RNA pode ser digerido durante a noite a 4 ° C no escuro. </li><li> Passe solução através de um filtro para remover células agregados e coletar células individuais em um tubo adequado para a captação de exemplo no seu citômetro de fluxo. Novamente, as amostras devem ser protegidas da exposição direta à luz. </li></ol> 3. A análise por citometria de fluxo <ol><li> As células devem ser analisadas por um citômetro de fluxo padrão que é capaz de discriminar doublets (duas células que passam através da célula de fluxo como um) com capacidade de detecção apropriados para propidium iodeto e FITC. Células individuais podem ser detectados no presente pedido de citometria de fluxo pela passagem para eventos baseado em dispersão para a frente e lado pop dispersãolamentos, e usando as propriedades de coloração de DNA pelo iodeto de propídio. A aparência de um gráfico de pontos doublet discriminação varia entre citómetros de fluxo e se baseia em propriedades coloração propidium iodeto, ver suas instalações citometria de fluxo locais para aconselhamento sobre a criação de um discriminador doublet em sua análise. Em geral, em uma população de maneira assíncrona proliferação de células, as células individuais são geralmente os dois picos mais abundante (2N e 4N DNA) na parcela doublet discriminar e um portão deve ser elaborado em torno deles. Isso irá selecionar os eventos única célula que são utilizados para todas as análises subseqüentes abaixo. </li><li> A primeira amostra a ser analisada deve ser uma cultura de forma assíncrona proliferando que serve como um controle positivo para a coloração e citômetro de fluxo set-up. Ajustar a sensibilidade de tubos fotomultiplicadores para propidium coloração iodeto de tal forma que os picos 2N e 4N a partir de células singlet estão centradas em 200 e 400 (unidades arbitrárias) no eixo-X. Que muitas vezes mancha uma abundante supply dessas células para garantir que todos os parâmetros do citômetro de fluxo foram ajustados de forma adequada sem usar essa amostra. Este controle positivo também é útil para os novos usuários a se familiarizar com o funcionamento do citômetro de fluxo. </li><li> Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tais que as populações G1 e G2 / M estão acima do fundo. Células BrdU positivas devem ser aproximadamente 10 vezes mais brilhante eo eixo Y deve ser exibido como uma escala logarítmica. Às vezes é útil incluir um controle negativo para a coloração de BrdU (substituindo os anticorpos anti-BrdU com os não-específicos de IgG no passo 2.3 acima) para distinguir claramente células marcadas positivamente. </li><li> Ajustar a compensação entre propidium iodeto e FITC tal que eventos únicos capturados pelo formulário citômetro de fluxo de um arco de ferradura em forma de G1 no canto inferior esquerdo até S-fase e para baixo no canto inferior direito para o G2 / M. Por favor, consulte a seguinte referência para uma análise mais profunda discussão dos princípios e uso de citometria de fluxo e referências lá para aplicações específicas 2. </li></ol> 4. A análise dos dados <ol><li> 5 000 a 10 000 eventos única célula com a gama de conteúdo pretendido DNA devem ser coletados para cada amostra, a fim de ter a confiança que a população de células na cultura têm sido exaustivamente amostradas. </li><li> Uma vez que as células têm sido medidos para propidium iodeto e conteúdo BrdU eles precisam ser atribuídos às fases G1, S ou G2 / M. Faça isso pelo desenho portões em torno das duas populações BrdU negativos centrados em 200 e 400 (G1 e G2 / M, respectivamente). Acima de tudo estas caixas devem ser incluídos em uma única porta que mede S-fase (Fig. 1A). A porcentagem de células em cada porta representa o número relativo de células em G1, S e G2 / M (Figura 1B). </li></ol> 5. Protocolo alternativo para a análise do ciclo celular em uma população mista de células <ol><li> Este protocolo alternativo émais útil quando a transfecção de vetores de expressão rotineiramente resulta em uma baixa percentagem de células que expressam o produto do gene de interesse, ou quando o tratamento medicamentoso para selecionar uma população pura de células é impraticável. Isso resulta em uma proporção relativamente pequena de células de interesse de ser contaminada com uma grande população de células untransduced. Neste caso, co-transfecção de plasmídeos expressando seu gene ou shRNA de interesse juntamente com um plasmídeo que expressa um marcador para a detecção de células transfectadas por citometria de fluxo, como uma membrana ancorada GFP 3, ou um marcador de superfície externa de células, tais como CD19 4 ou CD20 5. </li><li> Para efeitos do presente protocolo, vamos utilizar coloração CD20 como um exemplo, no entanto, coloração para CD19 é essencialmente idêntica. No caso de transfecção com CD20, não há necessidade de rotular BrdU, simplesmente células colheita conforme descrito nas etapas 1,2-1,5 acima e mancha pela adição de 20 mL FITC conjugado anti-CD20 anticorpos para as células na ice por 20 minutos no escuro. Fix células, como descrito em 1.6 passo. Células podem novamente ser armazenados por pelo menos um mês a 4 ° C no escuro. Para a detecção de GFP, omitir a coloração de anticorpos a partir desta etapa e corrigir e armazenar células como descrito. </li><li> Re-hidratar as células por peletização na centrífuga a 500 xg por 5 minutos e ressuspensão em 5 mL de PBS contendo BSA 1%. </li><li> Re-agregar as células a 500 xg por 5 minutos e ressuspender as células em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase, como descrito acima na seção 2.5. </li><li> Continue a seguir as instruções de preparação de células em 2,6 e análise instruções em 3.1 e 3.2. </li><li> Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tal que não coloridas estão acima do fundo. Idealmente, CD20-FITC células positivas será 10X a 100X mais intensamente manchado do fundo eo eixo Y deste lote deve ser exibido como uma escala logarítmica (Fig. 2A). Células CD20 positivas que são mais brilhantes do que 10X background (e com coloração propidium iodeto de entre 200 e 400) devem ser selecionados para exibição em um iodeto de propídio contra a contagem de células histograma como mostrado na figura. 2C. Para linhagens de células que expressam marcadores que são facilmente coradas intensamente (10X ou seja, a 100X acima do fundo), o CD20 positivo de corte deve ser definido no fundo de 10X. Inclusão de células mais fraca coloração aumenta a variabilidade nesses experimentos, presumivelmente porque o gene de interesse também é fracamente expresso nessas células. Para linhas de celular que só o rendimento fracamente coradas CD20 positivos (ou seja, menos do que o fundo de 10X), determinação de um off corte deve ser feito usando um controle negativo composto por CD20 manchadas, as células untransfected. </li><li> Pelo menos 1000 CD20 eventos positivos devem ser coletados para cada amostra. Experimentos com menos que 1000 irá produzir eventos alta variabilidade. Pacotes de software, tais como ModFit LT (Verity Software), Multi AV Ciclo (Phoenix Sistemas de Fluxo), e Jo Flow (Árvore Star) utilizar estimativas matemáticas deas populações G1, S e G2 / M que contribuem para a forma da curva em histogramas como os mostrados na figura. 2B e C. </li></ol> 6. Resultados representativos: Nós fornecemos três exemplos de análises célula experimental, utilizando o ciclo nossas abordagens. O primeiro usa a expressão retroviral inibidor da ciclina dependente p27KIP1 quinase em fibroblastos do ratinho embrionárias. Vinte e quatro horas após a seleção da droga para a infecção viral foi completa, as células foram marcadas com BrdU pulso durante uma hora. Neste experimento expressão ectópica do inibidor é usado para prender a proliferação das células (Fig. 3A e B). Como mostrado na figura. Eventos 3B pouco BrdU positivas são evidentes no portão fase S em resposta a p27. Da mesma forma, a porcentagem de células em fase S de células que expressam p27 é bastante baixo conforme ilustrado na figura. 3C. Este tipo de análise tem sido muito eficaz na caracterização da célula defeitos ciclo de controle em células derivadas de várias cepas de gene-alvo camundongos 6, 7, 8. No segundo experimento, não transformado células epiteliais mamárias (MCF10A) foram tratadas com a citocina inibitória de crescimento, transformando beta do fator de crescimento de um (TGF-β1) por 24 horas. As células foram marcadas com BrdU por quatro horas imediatamente antes da colheita. Como mostrado na figura. 4 rotulagem BrdU na fase S-células é muito diminuída por TGF-β1 sinalização, a especificidade da nossa coloração também é validado com um controle IgG negativo (Fig. 4C). Quantificação das diferentes fases do ciclo celular confirma que TGF-β1 principalmente inibe a proliferação na fase G1 do ciclo celular, levando a um acúmulo nesta fase. Em nosso último exemplo, pRB deficiente SAOS-2 células são transfectadas com um vetor CMV-CD20 expressão e quer CMV-RB ou CMV-β-Gal como um controle. Três dias após transfecção as células foram colhidas, coradas e fixo. Análise de citometria de fluxo dessas célulass é mostrado na figura. 5. Isso demonstra a distribuição do ciclo celular de células transfectadas controle negativo (Fig. 5A), em comparação com a seguinte distribuição de 72 horas de expressão PRB (Fig. 5B). Após ajuste de curva por software Ciclo Multi, uma comparação direta da proporção de fases do ciclo celular é mostrado na figura. 5C. Isso revela o acúmulo de células em G1 expressão pRB seguinte eo esgotamento relativo de células das fases S e G2 / M. Temos usado variações sobre este ensaio para sondar mecanismos prisão G1 extensivamente 9, 10, 11, 12, 13. Estes exemplos demonstram como controle do ciclo celular pode ser medido em resposta a uma variedade de estímulos ou manipulações de células. Esta abordagem pode ser adaptada para muitas aplicações que requerem a mensuração da posição do ciclo celular em experimentos tipo de cultura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" /> Figura 1. Quantitção das fases do ciclo celular por iodeto de propídio combinado e coloração BrdU (PI-BrdU). (A) Este painel exibe três citometria de fluxo dimensional de iodeto de propídio e células coradas BrdU. Note-se que as células com conteúdo de DNA 2N e 4N estão centradas sobre os 200 e 400 marcas na escala do eixo X para propidium intensidade de coloração de iodeto. BrdU intensidade de coloração é medido em uma escala logarítmica no eixo Y. Observe a posição dos portões usados ​​para quantificar células nas fases G1, S e G2 / M do ciclo celular. (B) A proporção relativa de células em cada um dos portões G1, S e G2 / M de A são mostrados neste gráfico. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" /> Figura 2. Determinação quantitativa de fases do ciclo celular em células selecionadas usando iodeto de propídio ea célula CD20 marcador de superfície. (A) Este painel mostra iodeto de propídio e CD20 coloração para uma mistura de células, algumas das quais ectopicamente expressar CD20 e pRb. Note-se que as células com2N e 4N DNA (as populações mais abundantes) estão centradas sobre os 200 e 400 marcas no eixo-X. A posição do CD20 + portão seleciona as células que estão manchadas pelo menos 10X mais brilhante do que de fundo. (B) Um gráfico de contagens de células versus propidium coloração iodeto é mostrado para CD20 células negativas no painel A que são assincronamente proliferando. (C) Um gráfico semelhante é mostrado para CD20 células positivas a partir do painel A que foram induzidos a prisão com a expressão pRB e contêm células com conteúdo de DNA principalmente 2N. Isso demonstra que um preso sub-população podem ser distinguidos de outras células nesta cultura usando esta técnica de coloração. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" /> Figura 3. Inibição da proliferação celular por p27KIP1. (A) PI-BrdU análise é usado para medir as fases do ciclo celular em uma população de maneira assíncrona proliferação de células que foram transduzidas com um vecto pBABE vazio retroviralr. (B) Uma análise similar das células transduzidas com pBABE-p27. Observe a ausência de células na fase S e maior intensidade de eventos no G1 e G2 / M portões. (C) A determinação quantitativa de células em cada fase do ciclo celular em forma assíncrona proliferação e controle de células que expressam p27. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" /> Figura 4. Inibição da proliferação celular por TGF-β1 (A) análise PI-BrdU de forma assíncrona proliferação de células MCF10A. (B) Análise das células tratadas com 100 pM de TGF-β1 por 24 horas. Observe o acúmulo de células principalmente na fase G1 do ciclo celular. (C) Validação de BrdU coloração, substituindo o anticorpo anti-BrdU primária com um controle de IgG não-específicas em células de forma assíncrona proliferando. (D) quantificação gráfica das fases do ciclo celular respectivos de A e B. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" /><br/&gt; Figura 5. Inibição da proliferação celular por pRb. (A) A contagem de células contra coloração iodeto de propídio de CD20 e gal-ß células transfectadas é mostrado. Este é um controle importante como a transfecção pode sincronizar parcialmente as células, tornando a população untransfected (CD20 - células) como um controle inadequado para o transfectadas sub-população. Células transfectadas precisam ser comparados com outras células transfectadas de forma análoga. (B) A contagem de células contra gráfico iodeto de propídio de CD20 e pRb transfectadas células. Note a presença quase exclusiva de um pico 2N. (C) Representação gráfica de proporções de células determinada fase do ciclo de A para B e usando métodos de ajuste de curva em software Ciclo Multi.

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Os autores não têm nada a revelar.

Em nossa experiência, o sucesso com estas técnicas é dependente de alguns controles fundamentais e das condições experimentais. Uma delas é estabelecer um controle de forma assíncrona proliferando para uso nesses experimentos. Este controle serve para três propósitos importantes. Primeiro, ele garante que as condições de cultura utilizado para todas as amostras experimentais são adequados para apoiar a proliferação contínua na ausência de tratamento. Este exemplo também serve ao propósito de um controle positivo para a metodologia de coloração para garantir que BrdU ou células CD20 positivo pode ser detectado quando eles estão presentes. Por último, esta amostra é usada para calibrar o citômetro de fluxo. Esta amostra de controlo pode ser usado para ajustar a intensidade da coloração propidium iodeto para detectar células 2N e 4N, 200 e 400, respectivamente. Além disso, a sensibilidade de detecção de BrdU ou CD20 pode ser ajustado de modo que os sinais negativos e positivos estão centradas, como mostrado nas Figuras 1A e 2A. Quando todas as amostras têm uma concentração semelhante de células na PI-RNase solução, então alguns ajustes para o citômetro são necessários como amostras subseqüentes são executados. Isto é importante por razões mostrado na figura. 4B e 5B onde a acumulação G1 forte cria essencialmente um pico G1 única que pudesse ser mal interpretado como G2 / M. Os experimentos representante também fazer outros pontos importantes. Primeiro de tudo, eles demonstram que BrdU captação e rotulagem podem variar entre os tipos de células. Por esta razão, é importante determinar empiricamente o comprimento do pulso e condições coloração necessária para a boa detectar células em fase S. Em geral, os tipos de células que dupla na cultura em 24 horas ou menos podem ser rotulados com BrdU em uma hora. Tipos de células em crescimento mais lento podem exigir pulsos mais longos e as alterações às condições de anticorpos coloração e duração. MCF10A células são um excelente exemplo a este respeito como eles foram marcados com BrdU por quatro horas e corados com o dobro da concentração padrão de anticorpos para quatro vezes mais tempo. Investigadoresdeve ter cuidado para não exceder 6 horas de BrdU rotulagem mesmo com células muito lentamente crescendo como isso pode erroneamente levar a inclusão de G2 / M células na população S-fase. Em segundo lugar, ao comparar os efeitos da expressão p27KIP1 com os de TGF-β1, é claro que p27 pode induzir um acúmulo em qualquer G1 ou G2 / M fases, enquanto TGF-β1 sinalização induz uma parada G1. Meios tradicionais de detecção de proliferação, tais como incorporação de 3 H-Timidina e contagem de cintilação são incapazes de distinguir essas possibilidades. Em nosso protocolo alternativo demonstramos a detecção de uma sub-população de células em uma população maior untransfected. É importante determinar empiricamente o repórter mais adequado para a detecção de células transfectadas. Em nossa experiência, quer alguns tipos de células expressam marcadores de superfície celular mal, ou não pode corretamente o tráfego deles para a membrana plasmática, resultando em uma incapacidade de detectar células transfectadas. Likewise, nem todas as células tolerar a forma de membrana ligado de GFP. Seleção do repórter mais adequado deve ser feita através da avaliação da eficiência de transfecção do repórter, bem como a intensidade relativa de expressão comparados aos controles untransfected. Idealmente, expressão heteróloga destas moléculas será bem tolerado e este é sugestivo de que os marcadores têm pouco ou nenhum efeito sobre a distribuição do ciclo celular. Uma limitação destes tipos de abordagens de citometria de fluxo é que eles só são capazes de estabelecer abundância relativa das fases do ciclo celular em relação um ao outro. Por esta razão, é ambígua se expressão da p27 na Figura 3 realmente induz a uma prisão no G1 e G2 / M, ou se ele apenas retarda a progressão por essas fases em relação ao S-fase. Estas possibilidades podem ser investigada por tratamento de uma amostra paralela de células com um inibidor mitótico, como Nocodazol, ou G1 / S, como inibidor aphidicolin. Uma vez que estas drogas criar uma dominaçãont prisão em M-fase ou fase-S no início, respectivamente, as células proliferam lentamente irá acumular no ponto de parada induzidas por drogas. Por exemplo as células preso em G1 por causa da expressão pRB permanecerá no G1, apesar do tratamento Nocodazol enquanto as células controle irá acumular em fase de M-13. Juntas, essas abordagens experimentais oferecem uma metodologia flexível que pode ser aplicado a uma ampla gama de células de mamíferos questões de investigação ciclo. Eles podem facilmente detectar alterações na progressão do ciclo celular e quantificar as diferenças quando comparados com os controles.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comments (opcional) </th></tr><tr><td> Célula reagente Labeling Proliferação </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpos anti-BrdU </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpos Anti-Mouse FITC conjugado </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Strain Filtros celular </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD20 Antibodies </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Software do Ciclo de vários </td><td> Sistemas de Fluxo de Phoenix </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cell cycle position in mammalian cells

A regulação da proliferação celular é fundamental para a morfogênese do tecido durante o desenvolvimento de organismos multicelulares. Além disso, perda de controle da proliferação celular está subjacente a patologia de doenças como o câncer. Como tal não há grande necessidade de ser capaz de investigar a proliferação celular e quantificar a proporção de células em cada fase do ciclo celular. É também de vital importância para indistinguivelmente identificar as células que replicar seu DNA dentro de uma população maior. Desde a decisão de uma célula a se proliferar é feita na fase G1, imediatamente antes de iniciar a síntese de DNA e progredindo pelo resto do ciclo celular, a detecção da síntese de DNA nesta fase permite uma determinação inequívoca do estado de regulação do crescimento em cultura de células experimentos. Conteúdo de DNA nas células podem ser facilmente quantificados por citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio, um corante fluorescente intercalando DNA.Da mesma forma, a síntese de DNA ativo pode ser quantificada pela cultura de células na presença de timidina radioativa, a colheita das células, e medir a incorporação de radioatividade em uma fração insolúvel em ácido. Temos uma experiência considerável com a análise do ciclo celular e recomendar uma abordagem diferente. Nós investigamos a proliferação celular usando bromodeoxiuridina / fluorodeoxyuridine (abreviado simplesmente como BrdU) coloração que detecta a incorporação destes análogos timina no DNA recentemente sintetizado. Rotulagem e coloração das células com BrdU, combinado com coloração DNA total de iodeto de propídio e análise por citometria de fluxo oferece uma medida mais precisa das células nas várias fases do ciclo celular. É o nosso método preferido porque combina a detecção de síntese de DNA ativo, através da coloração de anticorpos base de BrdU, com conteúdo de DNA total de iodeto de propídio. Isso permite a clara separação de células em G1, da primeira fase S, ou S final da fase G2 / M.Além disso, esta abordagem pode ser utilizada para investigar os efeitos de muitas células diferentes estímulos e agentes farmacológicos sobre a regulamentação da progressão por essas fases diferentes do ciclo celular. Neste relatório nós descrevemos métodos para a rotulagem e coloração células cultivadas, bem como a sua análise por citometria de fluxo. Nós também incluímos exemplos experimental de como este método pode ser usado para medir os efeitos de sinais que inibem o crescimento de citocinas como TGF-β1, e inibidores da proliferação, tais como o inibidor da quinase ciclina dependente, p27KIP1. Nós também incluímos um protocolo alternativo que permite a análise da posição do ciclo celular em uma subpopulação de células dentro de uma cultura maior 5. Neste caso, demonstramos como detectar uma parada do ciclo celular em células transfectadas com o gene retinoblastoma, mesmo quando muito ultrapassados ​​pelas células untransfected na mesma cultura. Estes exemplos ilustram as várias maneiras que a coloração do DNA ecitometria de fluxo podem ser utilizados e adaptados para investigar questões fundamentais de controle do ciclo celular de mamíferos.

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Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

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60.0K visualizações.  University of Western Ontario. Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Vídeo: Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Biologia

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Análise de Expressão de mamíferos Linker-histona Subtipos

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...