Os trypanosomes africanos são responsáveis pela triplosomiase africana humana, ou doença do sono e tripanosomiase animal africano. Os trypanosomos que causam a doença do sono são parasitas protistas transmitidos por moscas tsé-tsé presentes em muitos focos geográficos na África subsaariana. A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento.
Uma sorologia pode dar falso positivo e, infelizmente, resultados falsos negativos. Para ajudar na detecção do sangue, os tripanossomos devem estar concentrados. Várias técnicas de concentração de parasitas foram usadas.
O método mais sensível é a separação de parasitas do sangue por uma coluna de trocador de ânion, celulose DEAE seguida de centrifugação e observação microscópica. Consequentemente, o método de celulose DEAE é o melhor e permanece até o momento, o método de referência para visualizar e isolar parasitas do sangue para o diagnóstico de tripanosomiase africana humana, especialmente em condições de campo. Este método, o diagnóstico mais adequado para a triplosomiase africana também fornece parasitas purificados para investigações biológicas, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e moleculares.
Todas as investigações conformes ao guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e acordo foram obtidas das autoridades francesas e todos os protocolos utilizados foram aprovados pelo nosso comitê de ética local. Pesar cada substância de acordo com o protocolo escrito. Adicione água destilada e ajuste precisamente ao pH 8 com fosfato de dihidrogênio de potássio para fazer as seguintes soluções tamponadas, concentrado tampão de fosfato salina 2X.
Adicione água destilada e glicose para glicose salina tamponada com fosfato. Para 100 mililitros de tampão de elução, adicione 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 microgramas por mililitro de estreptomicina, e cinco microgramas mililiter de fenol vermelho à glicose salina tamponada fosfato. 100 gramas de celulose DEAE é primeiro lavada com três litros de água destilada e depois deixada para se instalar.
Partículas finas são descartadas. As lavagens são repetidas até que o supernatante esteja claro. O soro fisiológico tamponado 2X é adicionado e a celulose DEAE é agitada.
O pH é ajustado para oito com um fosfato de potássio molar. A celulose é então lavada duas vezes com água destilada e duas vezes com glicose salina tamponada de fosfato. A glicose salina tamponada de celulose DEAE e fosfato são misturadas em volumes iguais.
A ação esquartejada e armazenada à temperatura ambiente ou a quatro graus celsius ou a menos 20 graus celsius para armazenamento prolongado. O sangue infectado por tripanossomo é armazenado em nitrogênio líquido. Um litro de liga de um mililitro é descongelado à temperatura ambiente.
Os parasitas são cuidadosamente coletados do crioboto usando uma agulha e uma seringa de um mililitro. A viabilidade dos parasitas descongelados é avaliada pela motilidade visualizada pela observação da microscopia leve antes da infecção. Parasitas são injetados nas cavidades peritoneais de dois camundongos, 500 microliters por rato.
A cada dia após a infecção, a parasitamia é avaliada coletando uma gota de sangue da cauda com uma agulha e verificada por microscopia. Quando a parasitamia está em um nível adequado, o sangue infectado é coletado. Uma seringa de 10 mililitros é suportada em um grampo ou suporte e um pedaço de papel filtro pré-cortado é adicionado.
A celulose DEAE preparada é derramada na seringa até o nível de oito ou nove mililitros. A coluna é lavada com o tampão de eluição. Dois mililitros de sangue infectado são cuidadosamente colocados no topo da coluna e os trypanosomes são coletados na coluna elunato em um tubo de centrifugação de 50 mililitros.
O buffer de elução é adicionado regularmente de acordo com o trânsito de tripanossmos. O trânsito de trypanossomes através da coluna é verificado tomando uma gota de elunato de coluna em intervalos regulares e observando para trypanossomes usando microscopia leve. Quando os trypanossomos não são mais observados no eluato, o tubo cônico é centrifugar a 1.800 vezes G durante 10 minutos a quatro graus celsius.
O supernatante é descartado e os trypanossomes na paleta são contados com um hemócito. Os trypanossmos coletados são posteriormente diluídos no meio necessário para a investigação planejada. Este método, o diagnóstico mais adequado para a triplosomiase africana fornece parasitas purificados para investigações biológicas, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e moleculares.
Esses estudos foram desenvolvidos porque parasitas purificados de celulose DEAE podem ser facilmente obtidos em grandes quantidades de hospedeiros infectados naturalmente ou experimentalmente e, em particular, roedores. A viabilidade do tripanossomo na presença de agentes farmacêuticos é avaliada pela observação microscópica. A viabilidade do parasita está associada à motilidade e, portanto, pode ser verificada olho sob um microscópio leve a 40 vezes ou maior ampliação.
A viabilidade do parasita é avaliada medindo a porcentagem de formas motile. Diluições de compostos de teste são adicionadas em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 96 poços, enquanto poços de controle são tratados simulados. Cada concentração é avaliada em triplicado.
O número de parasitas viáveis para cada diluição é comparado com o número de parasitas em poços de controle. Os efeitos da Pentamidina, uma droga de referência, usada na terapia de tripanosomiase africana humana é exibida nesta figura. Co-culturas de macrófago trypanosome permitem a investigação da interação do parasita hospedeiro no nível celular.
Nas co-culturas de parasitas macrófagos, tripanossomos celulares extras induzem a produção de arginase macrófago que hidrolisa arginina à ornitina. Ornitina é o precursor de poliaminas e tripanothione, essencial para a sobrevivência e crescimento de parasitas. Além disso, o esgotamento da arginina diminui a produção de óxido nítrico trypanocida.
Posteriormente, a adição de um inibidor de arginase, S-L-cisteína às co-culturas reduz drasticamente o crescimento de parasitas induzidos pelo macrófago. A indução de arginase é mediada por fatores excretados e ou secretados. Este fator de indução de arginase foi identificado como uma cinesina orthina.
A cinesina se liga aos receptores de ligação de lectina lectina tipo C. Arginase é induzida e produz ornitina que favorece o crescimento de parasitas. Arginase não é induzida por cinesina em macrófagos cultivados com 12,5 miliame mannose ou em macrófagos de camundongos onde os receptores de manose do macrófago foram excluídos.
Outros exemplos de biologia celular e experimentação bioquímica usando tripanosse purificado de celulose DAEA são demonstrados em estudos onde novas proteínas citoesqueletal como BILBO1 foram identificadas. BILBO1 é necessário para a biogênese de importantes estruturas citoesqueletal e sobrevivência de parasitas. Assim, o BILBO1 representa um importante alvo de intervenção em tripanossomos patogênicos.
Uma imagem mostrando a rotulagem de imunoflourescência de uma forma de cultura de corrente sanguínea, célula de trypanosoma brucei sondada com um anticorpo anti-BILBO1 é mostrada nesta figura. Além disso, o metabolismo de glicose e threonina foram descritos usando triplóculos purificados de celulose DEAE e as enzimas envolvidas nesses processos foram validadas experimentalmente. Uma representação esquemática do metabolismo de glicose e threonina nos tripanossomos formados pela corrente sanguínea é mostrada nesta figura.
Purificação de tripanossos africanos do sangue por anion troca colunas de celulose DEAE com melhorias recentes continua sendo o padrão ouro para detecção de trypanosome, não apenas em hospedeiros naturais com baixa parasitamias em áreas endêmicas, mas também para a exigência de parasitas em grande número para investigações experimentais. As investigações permitiram identificar moléculas de tripanossomo desempenhando papéis essenciais na sobrevivência e crescimento dos parasitas. Alvos identificados podem representar a base para uma futura vacina com antígenos potenciais para humanos e animais em uma abordagem única de saúde.
