A purificação do F1-ATPase é baseada em métodos bioquímicos clássicos que se mostraram cruciais para nossa compreensão do mecanismo de produção de ATP por outras sínqueses atp. A principal vantagem desta técnica é que ela produz uma enzima altamente pura adequada para a determinação da estrutura por cristalografia de raios-X ou microscopia crio-elétron. Embora este protocolo seja otimizado para o isolamento do F1-ATPase a partir de tripanossomos, ele pode ser adaptado a outras fontes, como células de tecido ou cultura, e a vários protistas patogênicos.
Essa técnica pode levar à identificação de novos medicamentos para tratar doenças humanas graves. Por exemplo, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase é um alvo autenticado de drogas para o tratamento da tuberculose. Para iniciar o protocolo, descongelar e suavemente resuspendar vesículas mitocondriais, também conhecidas como mitoplastos, anteriormente isoladas por lise hipotônica de uma vezes 10 a 11 a 10 vezes 10 às 11 células do Procyclic Trypanosoma brucei em cinco mililitros de tampão a frio do gelo A.Mantenha a amostra refrigerada.
Em seguida, determine a concentração proteica na suspensão pelo ácido bicinchonínico, ou BCA, ensaio proteico de acordo com as instruções do fabricante. Realize uma série de diluição BSA em água ultra pura para construir a curva padrão. Diluir uma pequena quantidade da amostra 20 a 100 vezes com água ultra pura para se encaixar na faixa dos padrões BSA.
Depois de calcular a quantidade total de proteína na amostra, leve a concentração de proteína para 16 miligramas por mililitro, diluindo-a com buffer adicional A.Em seguida, fragmente os mitoplastos em vesículas invertidas e pedaços de membrana por sônica sete vezes por 15 segundos cada, com uma energia total de 70 a 100 joules por impulso com uma microtraícula com um diâmetro de 3,9 milímetros. Enquanto se fragmenta, incubar a amostra no gelo por 30 segundos entre impulsos. Após a sônicação, a suspensão pode parecer um pouco mais escura.
Sedimente os fragmentos de membrana por ultracentrifugação a 54.000 g durante 16 horas ou a 98.000 g por cinco horas a quatro graus Celsius. Decante o supernatante e prossiga com a extração de clorofórmio. Calcule o volume do Buffer B com base na quantidade total do Buffer A utilizado.
Transfira o sedimento congelado do tubo centrífuga para o homogeneizador. Resuspend a pelota de membranas mitocondriais no Buffer B com o auxílio de um pequeno homogeneizador Dounce. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros.
Remova a amostra do gelo e mantenha a amostra e todas as soluções à temperatura ambiente para as etapas restantes. Em seguida, adicione clorofórmio saturado com duas tris molares ajustadas com HCl para pH 8,5, um para um. Feche a tampa firmemente, e agite a amostra vigorosamente por exatamente 20 segundos.
Imediatamente centrifufique a mistura a 8.400 g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira a fase aquosa superior e nublada para microtubos de 1,6 mililitro. Adicione inibidores de protease à amostra para substituir os inibidores removidos pelo tratamento do clorofórmio.
Centrifugar as amostras a 13.000 g durante 30 minutos em temperatura ambiente. Após o giro, transfira o supernatante para microtubos frescos e repita a centrifugação para remover qualquer material insolúvel restante. Equilibre a coluna Q de troca de 5 mililitros de anion ligado a um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida com 50 mililitros de tampão de coluna Q a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto até que a absorvância a 280 nanômetros e a condutividade se estabilizem.
Carregue o supernatante na coluna equilibrada a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Aguarde até que a absorvância em 280 nanômetros se estabilize ao fundo. Aplique um gradiente linear de 25 mililitros do buffer de eluição da coluna Q de 0%a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto e colete uma fração mililitro.
Ensaio 10 microliters de cada fração individual correspondente ao pico de elução principal para atividade hidrolítico ATP por em mililitro de mistura de reação pelo ensaio Pullman ATPase em pH 8.0. Acumule as frações que exibem atividade ATPase. Concentre a amostra agrupada por ultrafiltração de membrana usando uma coluna de spin com um filtro PES de corte de peso molecular de 100.000 para 200 a 500 microliters.
Em seguida, proceda à cromatografia de exclusão de tamanho. Equilibre a coluna Superose 6 Aumente a fixação a um sistema de cromatografia líquida com pelo menos 48 mililitros de buffer SEC a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto. Aplique a amostra na coluna.
Execute a cromatografia a uma taxa de fluxo de 0,25 mililitros por minuto, enquanto coleta frações de 0,25 mililitro. Em seguida, execute 10 microliters das frações que correspondem aos picos do traço de absorção de UV 280 nanômetros no SDS-PAGE. Em seguida, manche as amostras com Coomassie Blue.
Teste as frações correspondentes ao primeiro grande pico contendo o pico da F1 para a atividade hidrolítico da ATP e sensibilidade azida pelo ensaio Pullman ATPase. Em seguida, realize um ensaio BCA para determinar a concentração de proteínas. Finalmente, mantenha o F1-ATPase purificado à temperatura ambiente e use-o dentro de três dias após a purificação para aplicações a jusante.
Este perfil de elução de uma cromatografia de troca de ânion exibe a absorvância UV em 280 nanômetros e a concentração de cloreto de sódio no tampão de elução. As frações selecionadas foram separadas no gel SDS-PAGE e manchadas com corante Azul Coomassie. As frações que correspondem ao pico de elução maior da cromatografia de troca de ânion e contêm o F1-ATPase foram agrupadas, concentradas e utilizadas como entrada para cromatografia de exclusão de tamanho.
O principal contaminante é o dihidrolipoyl desidrogenase, que eluutas da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho como um pico discreto. O F1-ATPase elutes no primeiro pico dominante, em grande parte simétrico. A coloração coomassie azul de um padrão de banda típica após a separação do F1-ATPase purificado via SDS-PAGE mostra bandas fracas esporádicas visíveis acima da subunidade beta, que representam subcomplexos do alfa três beta três headpiece, dimers e oligômeros das subunidades alfa e beta, e são desprovidos de quaisquer contaminantes detectáveis pela espectrometria de massa.
Ao realizar a extração do clorofórmio, a etapa crítica do protocolo, é essencial sacudir a amostra vigorosamente e prosseguir imediatamente para a separação centrífuga das fases orgânicas e aquosas. Após este procedimento, o F1-ATPase isolado pode ser caracterizado em detalhes pela espectrometria de massa. Além disso, pode ser usado em ensaios de atividade ou para estudos estruturais, seja por conta própria ou na presença de vários inibidores ou análogos de substrato.
