A terapia com células-tronco tem sido amplamente relatada como um tratamento promissor para muitas doenças. E as técnicas de folha de celular foram desenvolvidas para melhorar a retenção da célula e a sobrevivência dentro dos alvos, também. Durante a construção de folhas de células, o suprimento nutricional insuficiente continua sendo um problema fundamental para a perda da função das células-tronco, e é uma propriedade insatisfatória de células-tronco que finalmente afetaria os efeitos terapêuticos in vivo.
Nosso propósito de preparar o produto disponível de folha de células-tronco multicamadas, nossa equipe desenvolveu o andaime de postesização celularizada, pericárdio e folha de células. Com base no andaime, a entrada de células multicamadas seria rapidamente construída com hidrogênio não-inepto e um sistema de perfusão dinâmica é usado para garantir o fornecimento nutricional da célula-tronco in vitro. Pegue um andaime DBP seco e coloque-o no centro da base negra.
Coloque um anel de tensão branco no andaime DBP e afixe-o no porta-tecidos. Certifique-se de que o andaime DBP está totalmente fixado no porta-tecidos. Adicione 100 microliters de cultura no andaime DBP.
Coloque o andaime na incubadora Celsius de 37 graus e deixe-o de molho por 15 minutos. Retire as células da incubadora, remova os meios de cultura do prato de cultura, lave suavemente as células com dois mililitros de PBS quente. Remova todo o PBS do prato de cultura, e certifique-se de que nenhum líquido permanece.
Adicione dois mililitros a 1,25% de solução de trippsina ao prato e incuba as células por três minutos. Pare o efeito trippsina adicionando dois mililitros de cultura. Lave suavemente as células do prato.
Transfira as suspensões celulares em um novo tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar as células a 220 vezes a gravidade por cinco minutos, e obter sedimentos celulares. Remova o supernatante e elimine o sedimento celular.
Suspender as células com três mililitros 10% de solução de sacarose. Aspirar 10 microliters suspensão celular, e o número de célula de conteúdo lê um hemótmetro, extrair três milhões de células e transferir em seu novo tubo centrífugo de 1,5 mililitro. Centrifugar as células a 220 vezes a raiz quadrada por cinco minutos, remover completamente os supernacantes e obter o sedimento das células.
Prepare 20 microliters 10% solução de sacarose. Suspenda suavemente as células e obtenha uma suspensão uniforme. Adicione 20 microliter peptídeos de gel hidráulico na parte superior da suspensão misture suavemente o gel hidráulico peptídeo, e as células suspensão com o T, retire o andaime DBP, deixando o porta-tecidos e, em seguida, aspire suavemente a mediana do cálculo com um T.Aspire a mistura a mistura e adicione uniformemente ao andaime DBP.
Adicione um mililitro de cálcio na parte inferior do porta-tecidos. Adicione suavemente quatro mililitros culturais no prato de cultura e, em seguida, emergir a folha de células. Coloque as células na incubadora por duas horas deixe-a cultivar.
O sistema dinâmico de perfusão inclui um recipiente de cultura de perfusão o recreamento de troca de gás e uma garrafa de vidro. Montagens são sistemas dinâmicos de perfusão, como mostra a figura. Adicione duas medianas de cultura de hidrolitários na garrafa de vidro.
Insira a folha de células na câmara do recipiente de cultura, adicione três medianas de cultura mililitros no recipiente, coloque os sistemas dinâmicos de perfusão nas incubadoras e comece a bombear. Abra o recipiente de cultura no recumbent bipositivo. Retire a folha de celular do recipiente de cultura e coloque-a no prato de cultura.
Use um fórceps para imobilizar o portador do tecido e use outros dois fórceps para separar o anel de tensão branca da base negra. Finalmente, obtenha a folha de células multicamadas. O andaime DBP é transparente.
O SEM revende mostra que as faculdades capturadas e os componentes estão completamente reservados. As folhas de células podem ser obtidas e mantidas por fórceps para preservação curta. Estas folhas de celular podem ser transferidas para tubo cilíclita de 1,5 mililitro.
Como modelo, por exemplo, começando com exibições de células de BMFC's altamente positivos para as células-tronco marcador CD 9O e o CD 29. Após a construção da célula, o BMFC's que sai da folha de células permanece com altos níveis de expansão do CD 90 e do CD 29. Construir a estrutura celular multicamadas é o passo crítico do protocolo.
O tempo da panela requer quatro gel hidráulico quando o valor PH muda de SA para neutro, portanto, é importante lavar a célula com solução de sacarose para remover os íons superficiais. Além disso, a razão de volume de suspensão celular e panthihidrogel não é boa amiga para a construção da estrutura multicamada temporária. Após a formação da estrutura de células-tronco 3D, você verá que o sistema dinâmico de perfusão é importante para estabilizar a estrutura multicamadas, bem como manter as viabilidades das células-tronco.
A infiltração dinâmica da mediana da cultura poderia facilitar que as células-tronco se proliferassem e extrapolassem o contexto celular dentro da estrutura multicamadas também os termômetros de cultura dinâmica devem ser ajustados de acordo com diferentes tipos de células-tronco.
