Este método pode ajudar a enfrentar os principais desafios no campo da imunoterapia contra o câncer, facilitando o desenvolvimento de vetores oncolíticos para imunomodulação direcionada. A principal vantagem do sistema genético reverso aplicado é sua versatilidade;portanto, vetores podem ser adaptados para abordar várias questões de pesquisa e tumores alvo com diversas assinaturas imunológicas. As etapas de propagação do vírus especialmente determinando o ponto de tempo ideal para o vírus da colheita são difíceis de aprender a partir de um protocolo de texto, pois a formação de sincronia deve ser avaliada visualmente ao longo do tempo.
Para começar o projeto e clonar vetores imunomodulatórios recombinantes como descrito no manuscrito. Este protocolo descreve etapas específicas para o desenvolvimento de um vetor de vacina contra o sarampo oncolítico, codificando um engajador de células T bisespecífico. Para resgatar o vírus do sarampo do CDNA, 24 horas antes da placa de transfecção do vírus do sarampo, as células produtoras de vírus do sarampo estão uniformemente em uma placa de parede 6.
Sementes 200.000 células em 2 mililitros DMEM contendo 10% de FBS por poço para atingir 65 a 75% de confluência no momento da transfecção. Misture 5 microgramas de DNA recombinante codificando o antígeno do vírus do sarampo que será usado para transfetar as células. Plasmídeos apropriados e um repórter fluorescente em um volume total de 200 microliters de DMEM.
Adicione 18,6 microliters de reagente de transfecção liposômica à mistura e imediatamente aperte o tubo para misturar. Incubar esta mistura de transfecção por 25 minutos à temperatura ambiente. Para transfetar as células produtoras de MV, remova o meio da placa de 6 poços cultivada para 65 a 75% de confluência e adicione 1,8 mililitros de DMEM com 2% de FBS e 50 microgramas por mililitro Kanamycin por poço.
Em seguida, adicione a mistura de transfecção dropwise a cada poço e gire cuidadosamente. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte substitua o meio por 2 mililitros de DMEM frescos por 2% de FBS e 50 microgramas por mililitro Kanamycin e repita isso quando o meio se tornar ácido reconhecido pela cor amarela.
Use um microscópio para observar células diariamente para a expressão genética do repórter e a formação de sincronia. Quando uma grande sincronia composta por 20 ou mais células são visíveis ou quando as células se tornam muito densas, o vírus. 24 horas antes da colheita antecipada, cerca de 1,5 milhão de células produtoras de MV em 12 mililitros de DMEM com 10% de FBS em pratos de 10 centímetros para alcançar 65 a 75% de confluência no momento da inoculação do vírus.
Para coletar o vírus progyny use um raspador de células para raspar cuidadosamente células produtoras aderentes da placa de parede 6 com células transfectadas. Transfira o meio contendo as células raspadas em um tubo de centrífuga. Centrífuga por pelo menos 2500 vezes G e 4 graus Celsius por 5 minutos para remover detritos celulares.
Após a centrifugação misture o supernaente sem células com meio livre de soro a um volume final de 4 mililitros para preparar o inóculo. Remova o meio da antena de 10 centímetros com células produtoras de MV e adicione o inóculo às células. Incubar por pelo menos 2 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após a incubação adicione 6 mililitros de DMEM com 10% de FBS e incubar células durante a noite. Em seguida, substitua o meio por 12 mililitros de DMEM fresco por 10% de FBS e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até a colheita. Observe as células pelo menos duas vezes por dia.
Antes da sincronia estourar quando a interrupção da membrana se torna visível, o vírus. Para colher a primeira passagem remova o supernascer da placa e adicione 600 microliters de meio livre de soro. Em seguida, use um levantador de células para raspar as células e transferir para um tubo limpo.
Imediatamente depois disso congele a suspensão do vírus em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas para garantir o congelamento completo. Para determinar os titulantes dos estoques de vírus em octuplicates por alíquota usando 96 placas de parede. Primeiro puxe as células produtoras da cultura celular T75 em tubo cônico de 50 mililitros.
Conte as células e ajuste a suspensão celular para 150.000 células por mililitro no DMEM com 10% de FBS. Adicione 90 microliters de DMEM com 10% de FBS por poço de uma placa de parede de 96. Em seguida, adicione 10 microliters de uma alíquota do estoque do vírus a todos os 8 poços na primeira coluna da placa.
Misture bem por pipetar para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Use uma pipeta multicanal para transferir 10 microliters de cada poço, da primeira à segunda coluna, e misture bem por pipetar para cima e para baixo. Repita isso para cada coluna para obter diluições em série dez vezes do vírus usando pontas de pipeta frescas para cada etapa de diluição.
Descarte 10 microliters de cada poço da última coluna. Adicione 100 microliters de suspensão celular com 150.000 células por mililitro para cada poço certificando-se de que não há aglomerados celulares. Incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
Verifique se há sincronia usando um microscópio leve. Conte sincronia em cada poço da coluna com o maior fator de diluição contendo siníntia visível. Para vírus que codificam um repórter fluorescente, a sincronia pode ser contada usando microscopia de fluorescência.
Para análise da cinética de replicação do vírus do sarampo um dia antes da infecção, 100.000 células vero em 1 mililitro de DMEM com 10% de FBS por poço em 12 placas de parede com pelo menos 2 poços para cada ponto de interesse. Para infectar as células substitua o meio por 300 microliters de meio livre de soro contendo a respectiva quantidade do vírus. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 2 horas.
Remova o inóculo e adicione 1 mililitro de DMEM com 10% de FBS e continue a incubação. Em momentos relevantes, após a infecção, a colheita da proginia viral raspa diretamente as células no meio. Transfira o conteúdo de cada poço para um tubo individual.
Encaixe o congelamento em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius até a titulação e, em seguida, prossiga como descrito no manuscrito. Para iniciar a avaliação da citotoxicidade mediada por células induzidas pelo BTE pela liberação do LDH, primeiro isole produtos transgenes secretados expressos por células-alvo infectadas pelo vírus e isole células-efeitos imunológicos como descrito no manuscrito. Em seguida, células-alvo de sementes em uma placa de parede u-bottom 96 e incluem amostras como descrito no manuscrito.
Adicione imunomoduladores previamente isolados nas concentrações desejadas às respectivas amostras. Adicione células desertoras imunológicas nas razões desejadas e adicione o meio a um volume total de 100 microliters por poço. Incubar para os prazos previamente determinados desejados a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
45 minutos antes da coleta de amostras adicionar 10 microliters de 10X Lysis Solution a poços contendo amostras T max e os controles médios correspondentes e continuar a incubação. Centrifugar as células a 250 vezes G por 4 minutos. Transfira 50 microliters de supernascer de cada poço para poços de uma placa de parede fundo plano 96 certificando-se de não transferir as células.
Depois de preparar a solução de substrato de acordo com o fabricante adicione 50 microliters a cada poço. Incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos ou até que as amostras de T max se transformem em vermelho profundo. Após a incubação adicione 50 microliters de solução stop a cada poço.
Centrifugar por 1 minuto a 4000 vezes G e, em seguida, usar uma agulha oca para remover bolhas de ar. Meça a absorvância óptica em 490 nanômetros e calcule conforme descrito no manuscrito. Após a inoculação com vírus de sarampo não modificados e BTE codificação oncolítico, as curvas de crescimento dos vetores comparados em células vero parecem semelhantes.
Curvas de viabilidade celular em células de carcinoma colorretal de 38 murinas expressando o antígeno carcinomínico humano e os receptores MV CD46 após a inoculação mostram que a atividade lírica do vírus de codificação transgene fica para trás na linha celular do tumor murine. A citometria de fluxo de células expressas de antígeno alvo incubadas com BTE's em cinco diluições diferentes mostrou ligação BTE por células de forma dependente da concentração. No imunobloto após a retirada magnética das células associadas ao BTE mostrou que, quando foram utilizadas bte's não direcionadas, não havia quantidades detectáveis de células;enquanto que ao atingir amostras de BTE eram utilizadas células ligadas estavam presentes na fração de elução.
O antígeno específico e dependente de concentração de células murinas T é indicado pelo ensaio de liberação representativo do LDH e mostra que, no presente exemplo, 15% de mortes celulares específicas foram alcançadas a uma concentração de BTE relativamente alta de 1 micrograma por mililitro em comparação com as células de referência. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de monitorar regularmente as células para verificar a progressão da infecção. Não se esqueça que as cepas de vacinas contra o sarampo recombinante embora atenuadas podem ser perigosas especialmente para indivíduos imuno-suprimidos.
Evite a exposição seguindo os procedimentos de bio segurança adequados. Os indivíduos que manuseam vírus devem ser vacinados antes de realizar esses métodos. Após este procedimento, a expressão viral de mais transgenes pode ser alcançada a fim de analisar as interações e efeitos terapêuticos dos hospedeiros do vírus.
O desenvolvimento dessas técnicas abriu caminho para pesquisadores do campo da bioterapia explorarem os efeitos de imunomoduladores expressos localmente em inúmeras entidades tumorais;In Vitro, In Vivo, e também em ensaios clínicos.
