Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.

NOTA: Os protocolos utilizados foram aprovados pelo nosso Conselho de Ética de Pesquisa animal institucional da Universidade McMaster, de acordo com a Canadian Council on orientações de cuidados Animal. Os experimentos foram realizados nas instalações de McMaster University animal Central. 1. A cultura LCRT Cells <ol><li> Cultura de células LCRT em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Manter as células em frascos T-150 de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2. Células de passagem quando eles formam uma monocamada confluente a 90% (a cada 2-3 dias, a Figura 1). </li><li> 1x fosfato de pré-aquecer solução salina tamponada (PBS), 1x tripsina e meio num banho de água a 37 C ° durante 10 min antes da divisão das células. </li><li> Aspirar o meio do balão e lavar as células com 5 ml de PBS 1x. </li><li> Depois de enxaguar, aspirar PBS e incubaras células com 2 ml de 1x tripsina até células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. </li><li> Manter as células em um frasco T-150 semeando 1 ml de suspensão de células para 24 ml de meio (para um total de 25 ml por T-150) e um balão de rocha suavemente de lado a lado. Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2 até separação seguinte. </li></ol> 2. Avaliação de replicação do vírus e citotoxicidade nas células LCRT <ol><li> Replicação do vírus NOTA: as construções de vírus que expressam um marcador fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), sob o controlo de promotores virais endógenos facilitar a visualização da infecção pelo vírus e espalhado utilizando leitores de placas de fluorescência. <ol><li> Células LCRT semeado em placas de cultura, deixando um poço para contagem. Semear as células de modo a que eles vão ser de 80-90% de confluência no dia seguinte. Usar uma concentração de 10 5 cells / ml (100 ul por poço) para produzir o desejado confluência um dia mais tarde em placas de 96 poços de fundo plano. </li><li> No dia seguinte, pré-aquecer 1x PBS, 1x tripsina, meio completo e isento de soro em um banho de água a 37 C ° durante 10 min antes de se iniciar o experimento. </li><li> Aspirar o meio da contagem das células bem e lavar com 5 ml de PBS 1x por balançar-o sobre a superfície do poço. </li><li> Após lavagem, as células aspirado PBS e incubar com 2 ml de tripsina 1x até células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em um volume apropriado de meio completo para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes da inoculação do hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Determinar o volume de caldo de vírus necessária para a infecção na desejada multiplicidade de infecção (MOI). Necessário Paque Unidades Formadoras (pfu) = número de células plaqueadas * MOI(Ufp / célula) Volume de estoque de vírus required = necessária UFP / virus estoque título (ufc / ml) </li><li> Prepare inoculo de vírus em meio isento de soro em tubos. Misture bem em vórtice ou pipeta antes de adicionar inóculo para as células. </li><li> Infectar as células durante 1 hora a 37 ° C, após o que se aplica uma sobreposição de manutenção de DMEM + FBS a 1%. </li><li> Placas de digitalização um e dois dias após a infecção (pi) para visualizar fluorescência da GFP. </li></ol></li><li> Virus Cytotoxicity NOTA: Realize o ensaio resazurina citotoxicidade sob condições de pouca luz como o composto é fotossensível. A forma das cavidades contendo só deve ser incluído para corrigir para a fluorescência de fundo. <ol><li> Prepara-se uma solução a 5% (v / v) de resazurina em PBS 1x. Misture a solução por pipetagem. </li><li> Aspirar o meio das células e aplicar a solução de 5% de resazurina. Incluir um médio bem contendo apenas para corrigir a fluorescência de fundo. </li><li> Incubar as células durante 30 min a 37 ° C, depoisque ler a fluorescência utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação 530 nm, emissão 595 nm). </li><li> Analisar dados em relação aos controles não infectados corrigindo para fluorescência de fundo. </li></ol></li></ol> 3. Habitação e Manuseio <ol><li> Habitação e Diet <ol><li> Ratos Casa de algodão individualmente para diminuir no combate em gaiolas de ratos de policarbonato contendo cama de roedores (1/8 &quot;cama sabugo de milho), uma seção de tubo de PVC não mais de 8 polegadas e nestlets como enriquecimento (Figura 2). </li><li> Use um cesto de aço securable para sentar overtop da gaiola e conter alimentos de roedores e uma garrafa de água. NOTA: Esta configuração permitirá gaiola para captura segura e fácil de os animais, com a colocação do tubo de enriquecimento contra a extremidade da gaiola ser da maior importância. </li></ol></li><li> Manipulação <ol><li> Lidar com ratos de algodão na parte da manhã, antes de rodadas por técnicos das instalações dos animais para evitar emocionante-los antesum procedimento. </li><li> Durante todos os procedimentos, usar luvas de couro grosso para proteção. </li><li> Como os animais permanecem principalmente nos tubos de enriquecimento, utilizá-los para transferir os ratos a uma nova gaiola durante a limpeza de rotina. Como alternativa, abrir a gaiola um pouco para permitir que o manipulador para chegar ao seu lado dentro, o animal pode ser contido por scruffing a pele um pouco acima dos ombros e empurrando para baixo. Cuidados prática para não usar força excessiva quando o animal pode morder a língua. </li><li> Seja paciente e use uma mão firme como os animais têm uma forte resposta de fuga ou luta e vai tentar evitar a captura por correr e saltar para fora da gaiola. É importante ressaltar que não lidar com os animais pelo rabo como degloving irá ocorrer. </li><li> Armadilha os animais em seus enriquecimentos câmaras de ar sobre manipulação directa. Isso diminui drasticamente os ferimentos e escapar. </li></ol></li></ol> 4. Capturar e Anestesia <ol><li> Captura <ol><li> Usar luvas de couro grosso para proteçãoião positivo durante todos os procedimentos. </li><li> Utilizar um grande recipiente de plástico transparente com furos para o ar e uma tampa, uma câmara de indução anestésica suficientemente grande para se encaixar no recipiente e um cone de nariz montado no tubo de saída de gás (Figura 3). </li><li> Trabalhar em pares para tornar o processo mais eficiente e para diminuir o tempo de exposição dos animais ao isoflurano, um anestésico por inalação. Certifique-se de um pesquisador é responsável pela abertura e recolocar a tampa de aço sobre a gaiola e a tampa da câmara de indução (manipulador # 1) e seu associado é responsável pela captura do animal no tubo e transporte para a câmara de indução (manipulador # 2). </li><li> Coloque a gaiola sobre uma superfície plana e remover a tampa exterior. Levantar o tabuleiro de alimentação de aço ligeiramente e manobrar-se lentamente o tubo de enriquecimento por isso é paralelo com os lados da caixa e contra as costas. Se necessário, utilizar um objecto para manobrar o tubo de enriquecimento sem abrir a gaiola para evitar que o animal se agita (manusearr # 1). </li><li> Se o animal torna-se agitado e deixa o tubo, dá tempo suficiente para que o animal relaxar e, mais uma vez se estabelecer no tubo (manipulador # 1). </li><li> Lentamente e deliberadamente levantar a aresta da tampa de aço do tubo de enriquecimento, mantendo a outra extremidade em contacto com a gaiola. Faça um espaço grande o suficiente para o recipiente de plástico (manipulador # 2). </li><li> Em um movimento rápido e suave, empurre o recipiente de plástico overtop do tubo de enriquecimento. Manter o recipiente de contacto com o lado da gaiola, prendendo o animal no tubo. Realize os passos 4.1.6 e 4.1.7, o mais rapidamente possível (manipulador # 2). </li><li> Retire a bandeja de alimentação de aço e dar a tampa do recipiente de plástico para manipulador # 2 (manipulador # 1). Deslize a tampa de plástico entre o lado da gaiola e do recipiente, sendo conscientes de apêndices do animal preso no processo. Não selar o recipiente, pois isso fará com que o próximo passo mais difícil (manipulador # 2). </li></ol></li><li> AnesthesIA <ol><li> Certifique-se o recipiente permanece fechado e transportar o animal à câmara de indução. Rapidamente colocar o animal na câmara e remover a tampa do recipiente com um movimento fluido (manipulador # 2). Abra e substitua imediatamente a tampa da câmara de indução (manipulador # 1). </li><li> Ligue o fluxo de isoflurano para a câmara de indução (5 L / min) e monitorizar o animal quanto a sinais de letargia, altura em que deslizam rapidamente o animal a partir do tubo e o recipiente, tanto a remoção da câmara de indução para facilitar a circulação do gás. </li><li> Quando o rato é completamente anestesiados, movê-la para a superfície de trabalho e colocar o nariz e boca para o cone de nariz (Figura 3). O rato é totalmente anestesiado quando ele não responde a uma pitada toe forte. </li><li> Coloque vet vaselina pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secura e escoriações. Este é um passo essencial como ratos do algodão têm olhos grandes que podem ser propenso a infecção se ocorrer lesão. </li> &lt;li&gt; monitorizar cuidadosamente e manter uma taxa de respiração constante e garantir que o nariz do animal permanece no cone do nariz ao longo do procedimento de montagem. Ajustar o caudal de isoflurano apropriadamente. A quantidade de isoflurano necessária para anestesiar cada animal irá variar. </li><li> Pós-procedimento, devolver o animal para sua gaiola e garantir que ele recupere a mobilidade total e decúbito esternal. </li></ol></li></ol> 5. Preparação de Células LCRT para a Formação de Tumores subcutânea NOTA: Um balão T-150 de LCRT (90% de confluência) rende aproximadamente 2 x 10 7 células. Baseie o número de T-150 frascos necessários sobre o número total de células necessárias. Semente frascos adicionais para assegurar o número total de células necessárias é obtido e para acomodar células perdidas durante a preparação e os necessários para injecções extras. Mantenha as células no gelo sempre que possível para prolongar a viabilidade celular. <ol><li> Para colher as células, o meio aspirado a partir de um frascod células Lavar com 5 ml de 1x PBS. </li><li> Aspirar PBS e incubar as células com 2 ml de 1x tripsina até que as células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. Continuar a colheita de células de frascos adicionais. </li><li> Piscina todos suspensões de células em um tubo cônico, cerca de 4 T-150s por tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo a 160 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o meio e ressuspender o sedimento de células no volume apropriado de PBS (10 ml de PBS por T-150) para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes de carregar o hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Calcula-se o número total de células: Número total de células colhidas = contagem de células (células / ml) x volume de ressuspensão (ml) </li><li> Determinaro volume de suspensão de células necessário para todas as injecções. Faça 2-3 doses extras por experimento. Um total de 5 x 10 5 células LCRT injectados subcutaneamente irá formar tumores palpáveis ​​dentro de 3-4 dias. Número total de células necessárias = 5 x 10 x 5 células número total de doses Suspensão de células volume requerido (ml) = (número total de células necessárias * soma dos volumes de injecção) / (número total de células colhidas) </li><li> Pipete o volume pretendido de suspensão de células para um tubo cónico contendo PBS e homogeneizar. Alíquotas individuais injecções (100 ul) em tubos Eppendorf. Manter tubos em gelo durante o procedimento de injeção. </li></ol> 6. Injeções Observação: executar procedimentos com dois pesquisadores, um para executar as injeções, enquanto os outros monitores taxa de respiração do animal e condição geral e sob anestesia. Use seringas de insulina (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) para todas as injeções e uma nova agulha paracada animal. <ol><li> As injecções subcutâneas <ol><li> Capturar e anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Raspar o local da injecção usando cortadores. Pele de rato Cotton é grosso e requer um aparador afiada para obter uma superfície lisa para injectáveis. Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com as células por elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo do êmbolo de pressão até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Levantar a pele no local da injecção (referido como pele de acampamento) e inserir a agulha de bisel virado para cima. Certifique-se de que a agulha se move livremente sob a pele para evitar a injeção intramuscular. </li><li> Expelir o conteúdo da seringa lentamente e uniformemente. Retirar lado bisel da agulha para baixo. </li></ol></li><li> Injeções intratumoral <ol><li> Captura de umd anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com o inóculo do vírus através da elaboração lenta e progressivamente, mantendo a agulha na posição vertical. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Inserir a agulha lado bisel para cima para dentro do tumor e expelir o conteúdo da seringa de maneira uniforme e lentamente, enquanto move a agulha num padrão de tipo ventilador, retirar parcialmente a agulha antes de cada movimento para evitar laceração do tumor. Retirar lado bisel da agulha para baixo. NOTA: Os tumores LCRT subcutâneas são, atingindo aproximadamente 100 mm3 em 5-7 dias de rápido crescimento. Para além disso, centros necróticos e hemorrágicos frequentemente se formam na superfície do tumor no prazo de vários dias e requerem cAmonitorização REFUL (Figura 4). </li></ol></li><li> As injecções intraperitoneais <ol><li> Capturar e anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Limpe o local da injecção com 70% de etanol usando cotonetes e deixe-o evaporar completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com a droga através da elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen. Puxe o êmbolo para garantir que o sangue ou fezes não são aspirados, isso indica a colocação incorreta da agulha. Se isso ocorrer, retire a agulha e preparar uma nova seringa. Quando a agulha é colocada corretamente, expulsar conteúdo da seringa de forma uniforme e lentamente. </li></ol></li></ol> 7. Tumor Excisão e Necropsia <ol><li> Reunir e limpar alferramentas l com etanol 70% antes da eutanásia do animal. </li><li> Eutanásia o animal pelo método desejado, inalação de CO 2 (2 L / min, durante 5-10 min) é recomendado. Examine o animal para qualquer anormalidade na condição. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal numa prancha de dissecação e limpar o animal com etanol a 70%. </li><li> Use uma pinça para levantar a pele na parte inferior do abdômen. Cortar através da pele e do músculo utilizando tesouras e fazer uma incisão média a todo o comprimento do animal (ânus para o queixo). </li><li> Cortar a caixa torácica, fazendo dois cortes, uma lateralmente para cima o lado da caixa torácica e um em frente ao esterno para expor o coração e os pulmões. Examine os lobos do pulmão por quaisquer metástases 27,29. </li><li> Examine todos os órgãos de anormalidades e registrar quaisquer mudanças na cor, tamanho e consistência. Se necessário, os órgãos incisão com um bisturi para examinar os tecidos internos. Especificamente, examinar o fígado, rins, baço e do trato gastrointestinal. </li><li> Inspecione os linfonodos para metástases e alargamento 27,29. </li><li> Para recolher o tumor, fazer incisões flanco acima e abaixo do tumor de tal modo que a pele pode ser puxada para fora do corpo, com uma pinça. Enquanto segura firmemente a pele com pinças, usar um bisturi para remover cuidadosamente o tumor por corte entre o tumor e derme (Figura 5). </li><li> Colocar imediatamente o tumor em um recipiente rotulado de 10% de formalina tamponada neutra. </li><li> Dependendo do tamanho do tumor, permitir 1-2 dias (≤ 2 mm, pequenos) ou 5-6 dias (&gt; 2 mm, grande) para a fixação, antes de se prepararem secções para análise histológica (Figura 6). </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ICP0-Null+HSV-1+and+interferon+signaling+defects+in+the+effective+treatment+of+breast+adenocarcinoma.">The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma.</a> Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).</li><li>Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunization+with+recombinant+adenoviruses:+induction+of+immunity+and+protection+of+cotton+rats+against+respiratory+bovine+herpesvirus+type+1+infection.">Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection.</a> J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).</li><li>Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+pre-existing+adenovirus-specific+immunity+on+immune+responses+induced+by+recombinant+adenovirus+expressing+glycoprotein+D+of+bovine+herpesvirus+type+1.">The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1.</a> Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).</li><li>Mittal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+systemic+and+mucosal+immune+responses+in+cotton+rats+immunized+with+human+adenovirus+type+5+recombinants+expressing+the+full+and+truncated+forms+of+bovine+herpesvirus+type+1+glycoprotein+gD.">Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD.</a> Virology. 222 (2), 299-309 (1996).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syngeneic+Cotton+Rat+Cancer+Model+for+Replicating+Adenoviral+Vectors.">Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors.</a> Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).</li><li>Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).</li><li>Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent,+semi-permissive+cotton+rat+tumor+model+for+the+evaluation+of+oncolytic+adenoviruses.">Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses.</a> Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).</li><li>Steel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompetent+syngeneic+cotton+rat+tumor+models+for+the+assessment+of+replication-competent+oncolytic+adenovirus.">Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus.</a> Virology. 369 (1), 131-142 (2007).</li><li>Workenhe, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenic+HSV-mediated+oncolysis+shapes+the+antitumor+immune+response+and+contributes+to+therapeutic+efficacy.">Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy.</a> Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).</li><li>Sobol, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+antiviral+immunity+is+a+determinant+of+the+therapeutic+success+of+oncolytic+virotherapy.">Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy.</a> Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).</li><li>Prince, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cotton+Rat+in+Biomedical+Research.">The Cotton Rat in Biomedical Research.</a> Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), (1994).</li></ol>

The authors acknowledge there are no financial conflicts of interest related to this research.

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani...

Vírus Oncolíticos (OV) replicar selectivamente em células tumorais, explorando as diferenças bioquímicas entre células normais e tumorais 1,2. Existem dois tipos de VOs: aqueles que não necessitam de uma mutação para alcançar oncólise selectiva, referido como ocorrendo naturalmente vírus do tipo selvagem e as que devem ser modificadas para alcançar oncólise selectiva. A recolha de mutações dentro de um determinado tipo de tumor que determina a natureza da vantagem de crescimento selectivo sobre as células normais de um OV 2. A segurança e benefício de utilizar VOs foi demonstrada em ensaios clínicos 3-7. Apesar dos avanços no campo da virotherapy oncolytic existem lacunas entre os resultados pré-clínicos e clínicos, o que sugere que os melhores modelos são necessários para avaliar a eficácia antitumoral de VOs. Herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) é um membro da família Herpesviridae, e Alphaherpesviridae subfamília. BHV-1 initiates bovina complexo de doença respiratória em bovinos, manifestando-se em uma ampla variedade de sintomas semelhante a um resfriado 8,9. BHV-1 liga-se receptores de ligação de entrada e utilizados pelo HSV-1, tais como o sulfato de heparano e Nectin-1 10. No entanto, se liga CD155 no lugar de Nectin-2 10. BHV-1 tem uma gama de hospedeiros muito estreito de tal modo que ele não é capaz de entrar e iniciar a replicação em células de murinos normais e transformadas 3,4,10 eficientemente. Isso faz com que a utilização de modelos murinos convencionais problemático. A capacidade oncolitica do BHV-1 tem sido demonstrada in vitro 11,12. BHV-1 tem sido mostrado para iniciar a replicação e matar células de tumor humano a partir de uma variedade de origens histológicos, incluindo células de cancro da mama e cancro da mama iniciar células 11,12. No entanto, a capacidade antitumoral do BHV-1 deve ser avaliada in vivo no contexto de um hospedeiro imunocompetente. Adenovirus humano (Ad), para os quaishá 57 sorotipos identificados, mais comumente causa doenças respiratórias em humanos. Vectores Ad Oncolíticos foram avaliados quanto à sua eficácia antitumoral com vários avançar para ensaios clínicos 13-15. Apesar dos dados pré-clínicos promissores, os resultados clínicos têm ficado aquém das expectativas. Modelos de xenoenxerto de tumor humano são tipicamente usadas para estudar a eficácia antitumoral de vectores Ad, embora eles exibem atenua as respostas imunes ao vírus 16,17. Além disso, os modelos de murino singeneicas são não-permissiva para infecção ad, tornando a avaliação de respostas imunitárias do hospedeiro, utilizando estes modelos impraticáveis ​​17,18. O sistema imunitário do hospedeiro tem sido identificada como o mecanismo pelo qual mais influente VOs provocar a morte das células tumorais 19. Respostas antitumorais entre tornados tolerantes e antigénio associado a um tumor não tornados tolerantes modelos (TAA) diferem entre si e podem ter grande impacto no sucesso da terapia OV. O HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 em 1814 20) 20,21 provocou regressão do tumor em 80% dos murganhos portadores de tumor em um modelo de cancro mamário antigénio Polioma Médio T murinas 22. No entanto, em HER-2 modelos / neu, a eficácia antitumoral do KM100 variou entre 20% a regressão completa em camundongos singï¿½icos e estase tumor em transgênico, os ratos HER2-tolerantes. Juntos, esses dados destacam a importância de se avaliar plenamente VOs utilizando modelos animais que melhor recapitulam a paisagem imunológico humano para entender completamente o que caracteriza determinar o sucesso terapêutico. O rato de algodão (Sigmodon hispidus), indígena do Norte e América do Sul, é mais comumente usado como um modelo de infecção pelo vírus sincicial respiratório (como revistas em 5). Ratos do algodão, também são utilizados em-BHV-1 anti pesquisa de vacinação uma vez que recapitulam a patologia associada à doença respiratória bovina complexo 6,23. Além disso, o BHV-1 infecção de ratazanas do algodãoé imunogénica, induzindo mucosa sustentada e respostas imunitárias sistémicas 6,23-25. As linhas de células foram derivadas de fibrossarcoma espontânea e osteosarcomas da glândula mamária (LCRT) e osso (CCRT e VCRT), respectivamente 26. Ratos de algodão têm sido usados ​​para avaliar a eficácia in vivo de vectores Ad oncolíticos como eles são susceptíveis à infecção por Ad e exibem uma patologia semelhante à dos humanos 27-29. A utilização de modelos imunocomprometidos para a avaliação pré-clínica de VOs não são apenas menos indicativo de respostas clínicas para a terapia, mas eles não conseguem ter em conta o papel do sistema imunológico no viroterapia oncolítico 30,31. Portanto, o singeneicos e modelos de ratos tornados tolerantes algodão-tumorais de carcinoma da mama e osteossarcoma são modelos relevantes em que para avaliar a eficácia pré-clínica de VOs, tais como o BHV-1 e Ad que não pode ser estudado usando modelos murinos convencionais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>May use any brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can prepare in lab, filter to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030164</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>110-001-101HI</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-80</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate, flat bottom</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td>May use any brand, must be tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>May use an alternative reagent for determination of cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8640 Teklad 22/5 Rodent diet</td>
			<td>Harlan&#160;</td>
			<td>8640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; corncob rodent bedding</td>
			<td>Harlan</td>
			<td>7092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestlets</td>
			<td>Ancare</td>
			<td>-</td>
			<td>Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>May use any brand, must be sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>M60302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can prepare in lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>Model used not currently available</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio BioAnalyzer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R benchtop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Anaesthesia machine</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>Model used not currently available&#160;</td>
			<td>May use any brand, must be portable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wahl Peanut Mini Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td>May use any brand of small clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes 29 G x 1/2&#39;, 0.3 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat&#8217;s tough skin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>MedPro</td>
			<td>018-425</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8940</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-41</td>
			<td>May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

handling of the cotton rat in studies for the pre-clinical evaluation of oncolytic viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Devido à natureza extremamente excitável de ratos do algodão, sendo familiarizados com e utilizando processos optimizados para reduzir a tensão dos animais vai facilitar a sua utilização como um modelo animal de pré-clínico. O uso de técnicas de manejo adequadas também vai minimizar os riscos para o pesquisador. Ao usar ratos do algodão é imperativo para manter a calma. Os ratos são altamente excitáveis ​​e tentará escapar de sua gaiola. A utilização de um tubo de enriqu...

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Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

handling-cotton-rat-studies-for-pre-clinical-evaluation-oncolytic

Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K visualizações.  McMaster University. Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model. 

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex Infecção Vivo de tecido vivo com Vírus Oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Medicina

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

O Uso de desafio-Farmacológicas fMRI em pesquisa pré-clínica: aplicação ao sistema 5-HT

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

O uso de um baixo fluxo Sistema de Anestesia Digital para camundongos e ratos

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analisando Efeitos benéficos de suplementos nutricionais sobre as funções intestinais epitelial de barreira Durante Experimental Colite

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Avaliação In Vivo das Propriedades Mecanicas e Viscoelásticas da Língua do Rato

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Um modelo pré-clínico porcino de transplante cardíaco ortotópico

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Modelo pré-clínico de doação cardíaca após a morte circulatória

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...