Assim, este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a capacidade dos ligantes estrogênicos de regular o receptor de estrogênio alfa e os mecanismos dos moduladores seletivos do receptor de estrogênio. A principal vantagem dessa técnica é que é um método simples. Demonstra o receptor de estrogênio dependente do ligagênio alfa, atividade de dimerização de domínio nas células.
Demonstrando o procedimento será Tanner Jefferson, um estudante de pós-doutorado do nosso grupo. Este método usa três plasmídeos diferentes para detectar a atividade de dimerização de domínio de ligação do receptor de estrogênio nas células. pG5-Luc é o repórter de luciferase plasmid para detectar a eficácia da atividade de dimerização.
pBIND mouse estrogen receptor alpha EF é um fator de transcrição galactose-responsivo fator de transcrição GAL4 DNA vinculando-se a um principal mouse fundido estrogen alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmid que se liga ao elemento responsivo GAL4 no repórter pG5-Luc. pACT mouse estrogen receptor alpha EF é um vírus herpes simplex transativando proteína segmento VP16 ativação domínio fundido mouse estrogen receptor alfa ligante e expressão de domínio de ligação plasmid que não se liga diretamente ao repórter pG5-Luc. Quando o ligante adequado está presente, as proteínas derivadas do receptor de estrogênio do rato pBIND alfa EF e do receptor de estrogênio do rato pACT alfa EF plasmids se ligam através do domínio de ligação de ligas de ligação alfa do receptor de estrogênio.
A eficiência da dimerização é determinada pela atividade da luciferase. O passo mais importante é controlar a atividade do receptor de estrogênio alfa EF do rato pBIND. A atividade do receptor de estrogênio derivado do pBIND, o domínio alfa ligante alfa em cada ligante sem o receptor de estrogênio pACT alfa EF plasmid deve ser avaliado antes de analisar a atividade de dimerização do domínio de ligação do receptor de estrogênio dependente do ligante dependente do ligante.
Comece adicionando as combinações plasmidas apropriadas em dois tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro por combinação. Prepare as duas combinações da mistura de DNA. O primeiro tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos pACT vazios.
O segundo tubo contém o pG5-Luc, o receptor pBIND-estrogen-alfa EF, e os plasmídeos EF do receptor pACT-estrogen. Para precipitar o DNA, adicione 1/9 do volume de mistura de DNA de três acetatos de sódio molar e um volume de acetato de sódio molar de 20X de 100% etanol à mistura de DNA em cada tubo e vórtice dos tubos. Armazene as misturas a 20 graus Celsius durante a noite antes de centrifugar em velocidade máxima na manhã seguinte.
Descarte os supernantes e resuspenque as pelotas invisíveis em 120 microliters de 75% de etanol por tubo, tomando o cuidado de enxaguar qualquer DNA preso ao interior dos tubos. Após uma segunda centrifugação sob as mesmas condições, descarte os sobrenantes e seque o DNA em um concentrador de vácuo por 30 minutos. Para a transfecção, lave as células hepatocelulares hepatocelulares preparadas duas vezes com 0,5 mililitros de PBS de temperatura ambiente por poço por lavagem e alimente as células com 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado com soro bovino fetal inativado de 10% de carvão e dois milimolar de L-glutamina.
Em seguida, suspenda a mistura de DNA plasmídeo seco e reagente de transfecção no volume apropriado de DMEM por número de poços em tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um volume igual de médio reagente de transfecção a cada tubo de mistura de DNA plasmídeo suspenso pelo DMEM. Após uma incubação de cinco a dez minutos à temperatura ambiente, adicione 25 microliters de mistura de DNA aos poços experimentais apropriados da placa de cultura celular hepatocelular de 24 poços humanos para uma transfecção de seis horas na incubadora de cultura celular.
E o fim da incubação, substitua o meio de transfecção por 0,5 mililitros de MEM fresco de 37 graus Celsius sem fenol, complementado por FBS inativado por 10%carvão, dois milimolas L-glutamina, 1%de estreptomicina de penicilina e ligadura por poço e retornar as células à incubadora de cultura celular por mais 16 a 18 horas. Na manhã seguinte, lave as células com um mililitro de PBS por poço e conecte as células de cada poço com 100 microliters de tampão de lise passiva por poço e agitação vigorosa com um misturador de vórtice. Em seguida, congele as células lísatos em nitrogênio líquido.
No dia do ensaio de dupla luciferase, agite os lises em um shaker até que a placa atinja a temperatura ambiente, e transfira 10 microliters de lise para poços individuais de uma placa de plástico branca de 96 poços. Em seguida, leia a atividade luciferase de cada amostra de lisato celular em um leitor de microplacão. O tratamento do receptor de estrogênio pBIND alfa EF e pACT plasmids células transfectadas com 10 nanomolares estradiol estimula a atividade da luciferase, pois o domínio de ligação de ligantes alfa do receptor de estrogênio contém o domínio funcional de transativação dependente de ligante, AF-2.
No entanto, 1 e 10 concentrações de nanomolar, induzem a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrogen pBIND e pACT, sugerindo a viabilidade deste procedimento para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e de estrogen em até um nanomolar de tratamento estradiol. O tratamento com 4-hidroxifeno-tamoxifeno não provoca atividade luciferase no receptor de estrogênio do camundongo pBIND alfa EF e células transfetóides plasmidas pACT, sugerindo que a função AF-2 do receptor de estrogênio alfa não é ativada por este ligante. No entanto, até 10 concentrações de nanomolar, induz a atividade da luciferase nas células transfeinadas com a combinação de plasmídeos alfa EF do receptor de estrógeno pBIND e pACT, sugerindo que este procedimento é viável para avaliar a atividade de dimerização do domínio do receptor de estrogênio e estrógeno em até 10 nanomolar de tratamento 4-hidroxi-tamoxifen.
A atividade da combinação de pBIND e pACT mouse estrogen receptor alfa ligante expressão de domínio de ligação plasmídeos com 4-hidroxi-tamoxifen é significativamente maior do que a combinação de pBIND e pACT receptor humano de ligantes alfa ligante de expressão de domínio de ligação plasmídeos. Isso indica que a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato é mais potente do que o domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano. Além disso, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do rato contendo um domínio F humano é significativamente menor do que a do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio do tipo selvagem.
Em contraste, a atividade de homodimerização dependente de 4-hidroxifen-tamoxifen do domínio de ligação alfa do receptor de estrogênio humano contendo um domínio F do mouse é significativamente maior do que a do tipo selvagem do receptor de estrogênio humano domínio de ligação alfa. Isso sugere que o domínio F tem uma influência na atividade de homodimerização do receptor alfa de 4-hidroxifen-tamoxifen dependente da espécie. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de testar a atividade basal do domínio de ligação de DNA GAL4 fundiu o receptor de estrogênio alfa ligante alfa com o seu ligante.
Essa atividade deve ser a mesma que o tratamento do veículo.
