Os autores agradecem William Nance (Universidade de Michigan) para obter ajuda na formulação de protocolos de crescimento do biofilme e John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) para aconselhamento sobre questões tecnológicas relacionadas com o sistema BioFlux. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH: R21DE018820 a AHR) e da Universidade de Michigan fundos de arranque para AHR

O protocolo de coleta de saliva aqui descrito foi revisado pela Universidade de Michigan Institutional Review Board for Subject Pesquisa com Seres Humanos. NOTA: No que diz respeito a avaliações institucionais de trabalho sujeito humano deste tipo, acordos prévios e permissões devem ser obtida a partir da instituição de acolhimento. Em particular, dependendo da instituição, IRB ou aprovação ética pode ter de ser procurado e aprovado antes da coleta de saliva de voluntários humanos pode prosseguir. Como auxílio para a elaboração de um aplicativo, um algoritmo útil NIH / gráfico pode ser encontrada aqui: <a href="http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf">http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf</a> 1. Preparação de Saliva em pool para uso como meio de crescimento ambientalmente Germano <ol><li> Recrutar&gt; 5 pessoas para a doação de saliva. Não tome qualquer informação de identificação, garantir que não haja individuals vai doar saliva se eles estão doentes, ou tiver tomado antibióticos orais nos últimos 3 meses, ou ter alimentos ou líquidos consumidos, com exceção da água, no 2 horas antes da doação anterior. </li><li> Recolha saliva em tubos de 50 ml de plástico. A piscina do saliva coletada em um copo de plástico, mantendo-o no gelo. Não utilizar vidro como polímeros da saliva vai aderir às superfícies internas de vidro. </li><li> Adicionar ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 2,5 mM a partir de um estoque de 100x. (Stock é congelado em uso único alíquotas a -20 ° C). Agita-se durante 10 min num copo de plástico em gelo. </li><li> A fim de remover as partículas, a centrifugação da saliva reunidas durante 30 min a 17.500 x g. </li><li> Dilui-se a saliva com 3 volumes de dH 2 O para dar um quarto saliva concentrada. </li><li> Filtro-esterilizar saliva usando 0,22 polietersulfona (PES), filtro de baixa ligação protéica. Use filtro com grande área de superfície, ou usar vários filtros pequena área. Manter a saliva em umrecipiente de plástico sobre gelo e filtra. </li><li> Congelar a saliva reunidas a -80 &#160; ° C em tubos de plástico de 50 ml até ser necessário para crescer bactérias. Cada tubo de plástico é apenas para uma utilização e não deve conter mais de 35 ml, em cada poço de microfluidos pode conter um máximo de 1,2 ml (1,2 ml x 24 poços = 28,8 ml) e de espaço é necessário em cada tubo como saliva expande durante o congelamento. </li><li> Para utilização, descongelar a saliva reunidas à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, filtro de esterilizar mais uma vez (0,22 poliétersulfona, filtro de baixa ligação protéica para remover quaisquer precipitados). </li></ol> 2. Preparação de Saliva em pool para uso como inoculo <ol><li> Recrutar&gt; 5 pessoas para a doação de saliva. Não tome qualquer informação de identificação, garantir que não haja indivíduos vai doar saliva se eles estão doentes, tomaram antibióticos orais nos últimos 3 meses, ou ter alimentos ou líquidos consumidos, com exceção da água, no 2 horas antes da doação anterior. Recolha samples mais de 30 min. </li><li> Recolha de saliva em tubos de plástico de 50 ml à temperatura ambiente e partilhar a saliva recolhida num copo de plástico à temperatura ambiente. </li><li> Diluir saliva em pool com glicerol grau reagente geral autoclavada para produzir um estoque com uma relação final de 25% de glicerol, 75% contendo células saliva [CCS]. </li><li> Congelar a saliva a -80 ° C em 3 ml de partes alíquotas de uso único até que seja necessário. </li><li> Quando necessário para inocular o sistema de microfluidos, aliquotas são descongeladas à temperatura ambiente e agitada suavemente num agitador durante 5 segundos antes de ser pipetado para o sistema de microfluidos, tal como descrito no passo 3 do protocolo, abaixo. </li></ol> 3. O crescimento de biofilmes orais Multi-espécies <ol><li> Pré-tratamento de SFC <ol><li> Primeiro revestimento dos canais de microfluidos BioFlux com CFS. Adicione 100 ml de CFS para cada ponto de venda bem. Usando o software de controle BioFlux, selecione o fluxo de &quot;manual&quot; e definir a partir de canais tha &quot;B1-B24&quot;t são para ser usados. </li><li> Em seguida, ajustado a 1,0 cisalhamento dine / cm e iniciar o fluxo durante 2 min à temperatura ambiente para assegurar uma distribuição homogénea dos CFS ao longo do canal. Verifique se há fluido em cada canal de entrada para verificar se CFS fluiu através de todos os canais de maneira uniforme. </li><li> Incubar a placa à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Remover a solução / pré-tratamento CFS que permanece nas cavidades de saída e transferidos para os poços de entrada de ar. Este volume total de 100 uL irá servir para contrabalançar a pressão a ser aplicada para o inoculo da tomada bem. </li></ol></li><li> Inoculação <ol><li> Para cada ponto de venda bem, adicione 100 ml de CCS inóculo. Colocar a placa de microfluidos na placa de calor (a temperatura para 37 ° C), seleccione o manual dentro do software de controlo, e definir o fluxo de saída a partir de poços para os poços de entrada (isto é, inverter) a 1,0 dine / cm² durante exactamente 6 seg. </li><li> Incubar a placa de microfluidos a 37 ° C durante 40 min para permitirpara a adesão inicial e crescimento das bactérias no inoculo. </li></ol></li><li> Crescimento Overnight <ol><li> Para os canais inoculadas a ser utilizado, aspirar o inoculo a partir de resíduos de cada um dos poços de saída. Adicionar-se para 1 ml de volume total de SFC em cada um dos poços de entrada de ar (pode ser feito em cima de CFS existente). </li><li> Incubar a placa de microfluídica a 37 ° C, selecione manual e definir o programa a ser executado em 0,2 dine / cm² durante 20 horas. </li></ol></li><li> Stain pré-lavagem <ol><li> Aspirar todo o fluido a partir dos poços de entrada e de saída e adicionar 100 ul de PBS (pH 7,4) a cada um dos poços de entrada de ar. Fluxo durante 20 minutos a 0,2 dine / cm². </li></ol></li><li> Além mistura Stain <ol><li> Para a coloração viabilidade celular fazer 100 ml de mistura mancha para cada canal a ser manchada. Especificamente, adicionar 3 mL de SYTO 9 e 3 mL de iodeto de propídio por ml de PBS usando kit de coloração viabilidade celular comercial, como o Live / Dead. Isto gerauma mistura corante contendo 10 uM SYTO 9 e 60 de iodeto de propídio uM. </li><li> Aspirar o PBS remanescente dos poços de entrada de ar e, em seguida, adicionar 100 uL da mistura de mancha de viabilidade celular para cada entrada bem. Definir a fluir a 0,2 dine / cm 2 e executar a solução de entrada para a saída, durante 45 minutos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavagem pós-coloração <ol><li> Aspirar a mancha remanescente em cada um dos poços de entrada e adicionar 100 ul de PBS a cada poço de entrada. Definir a fluir a 0,2 dyne / cm e executar a solução de PBS de entrada para a saída, durante 20 min à temperatura ambiente para remover qualquer excesso de corante. </li></ol></li></ol> 4. coleção de imagens, renderização 3D e Análise de Imagem <ol><li> Use um microscópio confocal de varredura a laser invertido (CLSM) para coletar dados de imagem biofilme do sistema microfluídico. Certifique-se de que o CLSM é capaz de suportar o peso da placa BioFlux, que pode atingir 150 g. NOTA: Dada a dimensions dos canais microfluídicos, a necessidade de sensibilidade para discernir estrutura biofilme, e os requisitos para detectar o sinal de fluorescência de intensidade variável, encaixe a CLSM com uma NA lente objetiva ou um com qualidade similar óptico, ampliação e abertura numérica 40X 1,25. </li><li> Padronizar as portas de captura de emissões com ganho e compensados ​​medições sendo mantida constante. Certifique-se que a potência do laser não exceda 25%, pois isso pode resultar em foto-branqueamento. </li><li> Converta arquivos MCVL do L EICA I mago F tipo ile (LIF) para OME (O pen M icroscopy E nvironment) tipo de arquivo. Isto permite uma maior facilidade de acesso e a compatibilidade entre os programas de software. Use software disponível comercialmente, tais como, IMARIS para converter arquivos para este tipo. </li></ol> Rendering 3D para Imagens / Figuras <ol start="4"><li> Uma vez convertido para o formato OME, use um software disponível comercialmente como IMARIS para renderizar as imagensem 3D. Realize esta usando uma combinação de &quot;Easy3D&quot; e opções &quot;Surpass&quot;. NOTA: Atenção ao sinal de fundo e de limiar deve ser feita. A função de histograma em IMARIS pode ser usado para obter o intervalo de recolha e este deve ser mantido constante entre as imagens a ser analisado. </li><li> Salve as imagens usando a função &quot;snapshot&quot; e fazer uma análise cuidadosa para resolução de imagem antes de salvar tipos de arquivos. </li><li> Montar imagens em figuras usando software de edição de imagem como o CorelDraw ou Adobe Illustrator. </li></ol> Análise de Imagem 3D para Gráficos e Tabelas <ol start="7"><li> Use livremente disponível ImageJ 23 e COMSTAT / COMSTAT2 38 para análise de imagem. Faça o download dos pacotes a partir de http://rsb.info.nih.gov/ij/ e http://comstat.dk/, respectivamente. Já a mais recente atualização do Java instalado. NOTA: O JAVA plataforma de software terá de ser instalado prior para a utilização de software de análise de imagem. <ol><li> Use o software ImageJ com COMSTAT2 plugin para importar os arquivos de OME cada imagem biofilme no modo &quot;hyperstack&quot; e vista para com &quot;canais de divisão&quot;. </li><li> Individualmente analisar os dois canais (vermelho / propidium-iodeto / dead ser o canal 0, / ao vivo a ser canal verde / SYTO-9 1) utilizando a função &quot;histograma&quot; de ImageJ. Esta função lista o número total de pixels de arquivos de OME de 8 bits (indicados como &quot;contagem&quot;) em cada intensidade de cor de 0 a 255 (mostrado como &quot;valor&quot;), sendo 0 pixels sem sinal (ao fundo) e estar 255 pixels com saturação de sinal completo. </li><li> Exportar os dados para um programa de planilha e padronizar todos os valores de sinal pesando cada pixel pela intensidade do sinal correspondente. Isto é realizado através da multiplicação da contagem total para uma determinada intensidade de sinal do valor de 8 bits numérica (0-255) de que a intensidade do sinal. </li><li> Some todos os valores ponderados, 0-255, para ambos os canais de cada imagem capturada para biofilme. Tirar a soma dos valores ponderados para ambos os canais para determinar o sinal total por cento a partir de qualquer canal. Faça isso para determinar a relação familiar ou por cento vermelho e cento sinal verde (ou seja, a percentagem de &quot;morto&quot; e por cento &quot;ao vivo&quot; para cada tratamento). </li><li> Realizar análises estatísticas, por exemplo, utilizando de duas caudas T-Student modificado para variância desigual. Valores de p &lt;0,05 são considerados significativos e os valores de p &lt;0,01 são considerados altamente significativo. </li></ol></li></ol> 5. As células colheita biofilme para Análise de Cultura-independente <ol start="1"><li> Remover tudo saliva gasto e não utilizado de entrada e saída de poços. Lavar os poços com 1 ml de água destilada estéril, três vezes. </li><li> Adicionar 100 uL de água destilada esterilizada para os poços de entrada de ar e, utilizando a interface de controlo de software, a passarágua destilada estéril para a frente através dos canais em&gt; 8,0 dine / cm2 (caudal&gt; 745 mL / h, de cisalhamento de 800 seg-1) durante pelo menos 5 min. Repita no sentido inverso por pelo menos 5 minutos e, em seguida, repita o processo para a frente e para trás etapa de lavagem. </li><li> Verificar por luz ou por microscopia de epifluorescência (se as células foram coradas / marcado) para a remoção dos biofilmes profunda (Figura 2). Recolha a célula-suspensão de 100 ul e armazenar a -80 ° C para análise independente de cultura. A análise de custo-benefício da composição da comunidade pode ser alcançado através da utilização de bactérias codificado-tag FLX pyrosequencing amplicon (bTEFAP) utilizando a abordagem descrita em Nance et al 20. </li></ol>

<ol>
	<li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).</li><li>Wimpenny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+metropolis.">Microbial metropolis.</a> Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).</li><li>Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+ruin:+the+formation+of+disease-associated+oral+biofilms.">The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms.</a> Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).</li><li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li><li>Cate, J. M., Zaura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+numerous+microbial+species+in+oral+biofilms:+how+could+antibacterial+therapy+be+effective.">The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective.</a> Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).</li><li>Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+and+collective+recalcitrance+of+microbial+biofilm+communities.">The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities.</a> Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).</li><li>Anon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , (2011).</li><li>Smith, H., Smith, H., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. , 1-29 (1964).</li><li>Haffajee, A. D., Socransky, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+microbial+aspects+of+periodontal+biofilm+communities,+development+and+treatment.">Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment.</a> Periodontology. 42, 7-12 (2000).</li><li>McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4:+In+vitro+biofilm+models:+an+overview.">Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview.</a> Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).</li><li>Baehni, P. C., Takeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-plaque+agents+in+the+prevention+of+biofilm-associated+oral+diseases.">Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases.</a> Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).</li><li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis.">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).</li><li>Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+oral+microbial+communities+of+wild-type+and+toll-like+receptor+2-deficient+mice+using+a+454+GS+FLX+Titanium+pyrosequencer.">The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer.</a> BMC microbiology. 10, 101 (2010).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+subject-specific+oral+microflora+during+initial+colonization+of+enamel.">Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel.</a> Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).</li><li>Auschill, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+two+antimicrobial+agents+on+early+in+situ+biofilm+formation.">Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation.</a> Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).</li><li>Coenye, T., Nelis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+model+systems+to+study+microbial+biofilm+formation.">In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation.</a> Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+biofilms+in+antimicrobial+resistance.">Role of biofilms in antimicrobial resistance.</a> ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).</li><li>Wimpenny, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+validity+of+models.">The validity of models.</a> Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).</li><li>Umland, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-validated+essential+genes+identified+in+Acinetobacter+baumannii+by+using+human+ascites+overlap+poorly+with+essential+genes+detected+on+laboratory+media.">In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media.</a> 3 (4), (2012).</li><li>Nance, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+dental+plaque+biofilm+system+to+visualize+and+quantify+the+effect+of+antimicrobials.">A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).</li><li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li><li>Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+approaches+for+multidimensional+biological+image+data.">Visualization approaches for multidimensional biological image data.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+an+alcohol-free+CPC-containing+mouthwash+against+oral+multispecies+biofilms.">Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms.</a> The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).</li><li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology.">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).</li><li>Kim, J., Park, H. D., Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+to+bacterial+biofilm+formation.">Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation.</a> Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).</li><li>Mosier, A. P., Cady, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+bacterial+surface+interactions+using+microfluidic+systems.">Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems.</a> Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).</li><li>Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multispecies+oral+bacterial+community+in+a+saliva-conditioned+flow+cell.">Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell.</a> Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).</li><li>Cuadra-Saenz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer-2+influences+interactions+amongst+pioneer+colonizing+streptococci+in+oral+biofilms.">Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms.</a> Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).</li><li>Rickard, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinducer+2:+a+concentration-dependent+signal+for+mutualistic+bacterial+biofilm+growth).">Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth).</a> Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).</li><li>Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+penetration+and+efficacy+in+an+in+vitro+oral+biofilm+model.">Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).</li><li>Diggle, M. A., Clarke, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+sequence+typing+at+the+speed+of+light.">Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light.</a> Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).</li><li>Hiyari, S., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+diagnostics:+molecular+analysis+of+oral+biofilms.">Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms.</a> Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).</li><li>Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+biofilms:+emerging+concepts+in+microbial+ecology.">Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology.</a> Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+in+the+age+of+genomics+and+metagenomics:+concepts,+tools,+and+recent+advances.">Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances.</a> Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).</li><li>Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+bacterial+infections+through+culture-independent+approaches.">Studying bacterial infections through culture-independent approaches.</a> Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).</li><li>Socransky, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota+of+the+gingival+crevice+area+of+man.+I.+Total+microscopic+and+viable+counts+and+counts+of+specific+organisms.">The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms.</a> Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).</li><li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).</li><li>Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+adherence+and+colonization.+Microbiology+and+molecular+biology+reviews).">Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews).</a> MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).</li><li>Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+spatial+distribution+of+viable+and+nonviable+bacteria+in+hydrated+microcosm+dental+plaques+by+viability+profiling.">Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling.</a> Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).</li><li>Adams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+laboratory+model+to+assess+the+removal+of+biofilm+from+interproximal+spaces+by+powered+tooth+brushing.">Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing.</a> American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).</li><li>Ledder, R. G., McBain, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+comparison+of+dentifrice+formulations+in+three+distinct+oral+microbiotas.">An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas.</a> Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).</li></ol>

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Este papel métodos destaca as etapas básicas necessárias para configurar e executar um sistema microfluídico de forma a permitir o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies orais derivados da saliva humana reunidas e cultivadas em esterilizada por filtração de 25% reunidas saliva humana. Abordagens para a caracterização do biofilme são dadas, mas deve-se lembrar que essas abordagens descritas são modificáveis ​​e tecnologias adicionais, como, por exemplo, manchas ou rótulos podem ser introduzidas. Por...

<html> Os biofilmes são arquitetonicamente complexas comunidades de bactérias que são agregados em superfícies 1. Estas comunidades geralmente contêm numerosas espécies que interagem uns com os outros dentro do biofilme 2. Biofilmes orais, o mais visualmente notável sendo a placa bacteriana, são um problema persistente em seres humanos e os seus resultados para o desenvolvimento incontrolado de geração de taxonomicamente diversas comunidades multi-espécies 3. As bactérias que compõem essas diversas comunidades pode ser de até 1.000 vezes mais resistentes aos antimicrobianos do que os seus (planctônicas) vias de livre flutuação 4-6. A falta de tratamento destas comunidades do biofilme dental, que podem causar cárie dentária e doença periodontal, resultou em um encargo significativo de saúde pública: mais de 500 milhões de visitas ao consultório de dentista por ano em os EUA, e uma cerca de 108.000 milhões dólares para tratar ou prevenir periodontal doença cárie dentária e 7. content &quot;&gt;&quot; Enquanto muitos microbiologistas defender o estudo do comportamento microbiano em condições naturais, alguns deles fazê-lo. Isto porque a sua moral para superar as dificuldades é constantemente solapada pela facilidade atraente de trabalhar com culturas de laboratório. &quot;-Smith 8. Actualmente, a investigação biofilme bucal é realizada usando uma variedade de in vivo e in vitro abordagens, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens 9,10. In vitro abordagens costumam usar sistemas de biofilme modelo que são relativamente fáceis de configurar, mas podem faltar clínico / relevância no mundo real 10,11. In vivo abordagens normalmente dependem de sistemas de modelos animais que podem reproduzir certos aspectos do ambiente oral humana, mas novamente sofrem de limitações devido a diferenças na anatomia, fisiologia, microbiologia e imunologia entre animais e humanos 12, 13. Deve notar-se que os biofilmes oraistambém podem ser desenvolvidos em superfícies de esmalte, realizada em um stent dentro da boca dos voluntários humanos, mas esta abordagem é actualmente relativamente caro e 14,15 de trabalho intensivo. Em última análise, novos agentes e tecnologias para melhorar a saúde bucal são testados em seres humanos em condições de ensaios clínicos controlados 11. No momento, um modus operandi muito usada para identificar e avaliar novos agentes de saúde bucal é a primeira a realizar estudos de laboratório para discernir eficácia potencial, e, em seguida, realizar estudos com animais e os &quot;testes de campo&quot; que empregam os clínicos para avaliar o sucesso da tecnologia 9, 16,17. Infelizmente, os estudos de laboratório tendem a confiar em sistemas modelo que ocupam uma grande pegada, são tecnologicamente difícil de usar, e muitas vezes contêm comunidades de um ou, no máximo, algumas espécies simplificado para derivar potencial do mundo real que significa 10,18. Dado que o biofilme da placa dental conter várias espécies e em forma de quex fluir meio salivar, o desenvolvimento de biofilmes que contêm uma ou algumas espécies em é pouco provável para gerar comunidades que se comportam de um modo semelhante às de um cenário real 10,19 meios artificiais. Para lidar com o tempo, custo, requisitos de formação, bem como a natureza representativa pobre de sistemas de biofilme modelo de laboratório em comparação com o ambiente do mundo real, que recentemente desenvolveu uma alta taxa de transferência e sistema de biofilme ambientalmente germane 20 (Figura 1). Os benefícios do sistema a partir da utilização de livre de células saliva humana em pool (CFS) como meio e não tratada reunidas saliva contendo célula bacteriana humana (CCS) como inóculo. Excepcionalmente, o sistema também combina a tecnologia microfluídica, um microscópio confocal de varrimento laser e tecnologia de análise de diversidade bacteriana independente de cultura. Assim, o sistema de modelo é ambientalmente pertinente (usando saliva como um inoculo para crescer biofilmes multi-espécies a 37 ° C em esterilizada por filtração de fluxosaliva) e os biofilmes orais contêm espécies (incluindo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, e espécies de Porphyromonas) em abundâncias representativos dos encontrados no início de placa supragengival 20. Ao considerar que este trabalho descreve o uso do sistema de modelo recém-desenvolvido, deve ser dada especial atenção à fusão de um microfluidics microscopia confocal a laser (CLSM) e tecnologias de análise de diversidade independentes de cultivo. A união destas tecnologias por nosso grupo de pesquisa foi intencional e não só acrescenta uma capacidade de alto rendimento para o sistema modelo recém-desenvolvido, mas também permite perguntas a serem feitas que não poderia ser facilmente tratadas antes com outros sistemas. Em primeiro lugar, CLSM tem vantagens distintas em relação microscopia tradicional, uma vez que permite a análise tridimensional de biofilmes. Muitas vezes desvalorizado, isso é extremamente importante como biofilmes são sagacidade heterogêneoh relação à composição de espécies e posição espacial, bem como as condições fisiológicas sendo impostas em diferentes localizações espaciais dentro do biofilme 6,21. Em conjunto com software tridimensional de renderização e software de análise de imagem, a arquitetura do biofilme, as relações espaciais entre as espécies que o compõem, e extensão da morte antimicrobiana pode ser analisado 22-24. Tais habilidades não são possíveis com o padrão de luz transmitida ou microscopia de epifluorescência. Em seguida, a microfluídica já recebeu atenção especial no campo da microbiologia, pois permite o estudo de biofilmes sob condições cuidadosamente controladas (vazão, temperatura, pH, etc.) e requer apenas pequenos volumes de líquido 25-27. Como ponto de comparação, crescimento de um biofilme oral na saliva humana dentro de um sistema modelo de célula de fluxo (um sistema que é considerado sem dúvida o modelo de esteio para muitos estudos do biofilme dental) por 20 horas a uma velocidade de fluxo semelhante e ao cisalhamento, em que alcançouem um sistema de microfluidos requer pelo menos 200 ml, em oposição aos 800 ul no dispositivo de microfluidos 28-31. Assim, um modelo de sistema de microfluidos biofilme permite o estudo de materiais limitam-lote sob condições definidas. Finalmente, a tecnologia pyrosequencing foi otimizado na última década para exigir que apenas pequenas quantidades de material para realizar uma análise da comunidade e é suficientemente versátil para controlar a profundidade de sequenciamento para obter a identidade das espécies biofilme ainda raras. O uso desta tecnologia, tais como bactérias codificado-tag FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP), permitiu perguntas pertinentes sobre a ecologia de biofilmes de ser abordada 32,33. Tais questões imbuído dificuldades no passado, quando pyrosequencing não estava disponível por causa do tempo e os custos necessários para criar bibliotecas de plasmídeos e as etapas tecnológicas e analíticas complexas necessárias para obter dados 33,34. É claro que uma grande vantagem com ap independente de culturaabordagens, tais como pyrosequencing, é que as espécies bacterianas que não podem ser cultivadas em isolamento dentro de meios convencionais de laboratório (espécies ou seja viáveis ​​mas não cultiváveis) podem ser cultivadas e identificado no sistema de modelo e a sua abundância relativa na comunidade quantificada 35, 36 . Para adicionar perspectiva, já em 1963, o atraso Sigmund Socransky estimou que aproximadamente 50% das bactérias no material isolado a partir do sulco gengival oral humana não poderia ser cultivadas utilizando condies de crescimento laboratoriais 37. O objetivo deste artigo é descrever métodos de abordagem para desenvolver biofilmes multi-espécies orais em um sistema microfluídico comercialmente disponível (BioFlux) em: (i) condições representante da cavidade oral humana e (ii) com uma composição e abundância das espécies que é comparável à placa supragengival. Além disso, usando tanto software freeware e comercial, destacamos biofilme como basemedidas de arquitetura pode ser derivada a partir de dados MCVL, com foco em abordagens para quantificar a biomassa do biofilme, aspereza, e viabilidade (com base em coloração Live / Morto). Finalmente, os passos necessários para a colheita de material para análise da diversidade de biofilme por bTEFAP são descritos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="951">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:525px;">SUPPLIES AND EQUIPMENT</td>
			<td style="width:224px;">AVAILABLE FROM COMPANY</td>
			<td style="width:203px;">CATALOG NUMBER</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP172-5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorval ultracentrifuge&#160; (SS-34 compatible)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Unit-dependent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific SS-34 Rotor&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>28-020</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water</td>
			<td>Thermo&#160; Scientific Inc</td>
			<td>23-290-065</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>73520-986&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>NC0542269</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioFlux microfluidic system</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>Bioflux 200 system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux 24-channel plate</td>
			<td>Fluxion</td>
			<td>910-0004</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Gibco)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>10010023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIVE/DEAD stain (Invitrogen)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7012</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>SPE or eqivalent system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrosequencing facilities</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Decon SaniHol 70 Ethanol Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-122</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Ultra Low Temperature Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips (20, 200, and 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1000uL)</td>
			<td>Multiple choices</td>
			<td>Multiple choices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOFTWARE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflux dedicated software</td>
			<td>Bioflux</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leica SPE</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">COMSTAT/COMSTAT 2</td>
			<td colspan="2">Freeware (http://www.comstat.dk/)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of a high-throughput in vitro microfluidic system to develop oral multi-species biofilms

Há poucos de alto rendimento em sistemas in vitro que facilitam o desenvolvimento de biofilme multi-espécies que contêm numerosas espécies comumente detectados dentro in vivo biofilmes orais. Além disso, um sistema que utiliza a saliva humana natural como fonte de nutrientes, em vez de meios artificiais, é particularmente desejável de modo a suportar a expressão de propriedades celulares e específicos de biofilme que imitam as comunidades in vivo. Descreve-se um método para o desenvolvimento de multi-espécies biofilmes orais que são comparáveis, no que diz respeito à composição das espécies, a placa dental supragengival, sob condições semelhantes para a cavidade oral humana. Especificamente, este artigo descreve métodos como um sistema de microfluidos disponível comercialmente pode ser adaptada para facilitar o desenvolvimento de múltiplas espécies biofilmes orais derivadas e cultivadas dentro de saliva reunidas. Por outro lado, uma descrição de como o sistema pode ser utilizado em conjunto com um confocal microscópio de varredura a laser para gerar 3-D reconstruções biofilme para análises de arquitectura e de viabilidade será apresentado. Dada a grande diversidade de microrganismos que crescem dentro de biofilmes no sistema microfluídico (incluindo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella e Porphyromonas), um protocolo também será apresentado descrevendo como a colheita das células do biofilme para posterior subcultura ou extração de DNA e análise. Os limites tanto do sistema de biofilme microfluídicos e as análises de dados state-of-the-art atuais serão abordados. Em última análise, é previsto que este artigo irá fornecer uma linha de base técnica que vai melhorar o estudo de biofilmes orais e auxiliar no desenvolvimento de tecnologias adicionais que podem ser integrados com a plataforma de microfluidos.

Rendering 3D de biofilmes Os resultados representativos são apresentados na Figura 3. Uma ferramenta útil em software IMARIS é a opção de examinar cada fatia da pilha de biofilme recolhido e combiná-los para criar reconstruções tridimensionais. Além disso, os efeitos de sombras artificiais podem ser adicionados para ajudar visualmente interpretar as estruturas tridimensionais. Os biofilmes prestados pode ser orientado em qualquer direção ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms at JoVE.com

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

use-high-throughput-vitro-microfluidic-system-to-develop-oral-multi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

13.4K visualizações.  The University of Michigan.  O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados. 

Vídeo: Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Bioengenharia

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Análise sistemática de<em&gt; In Vitro</em&gt; Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

Otimizando o uso de um robô de manipulação líquidos para conduzir a uma alta taxa de transferência para a frente química genética tela de Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...