Há necessidade de um método preciso e de alto rendimento para medir anticorpos neutralizantes RSV, como um importante marcador de proteção contra vírus sincicial respiratório. Este método é altamente reproduzível com variações entre ensaios para o antiserum de referência sendo inferior a 10% Acreditamos que este ensaio pode ser facilmente estabelecido em muitos laboratórios em todo o mundo a um custo relativamente baixo. Descrevemos aqui um ensaio de micro-neutralização baseado em imagem que foi testado no subgrupo A do RSV, e também pode ser adaptado para o subgrupo B RSV e diferentes tipos de amostras.
O procedimento será Reuben Tse, membro da equipe de pesquisa do MCRI. Para as placas de sementes no primeiro dia, primeiro resuspende células A549 em mídia DMEM, com 10% FCS e 1.000 unidades Mistura penicilina-estreptomicina a uma concentração de 400.000 células por mililitro. Em seguida, sementes 96-bem flat-bottom placas estéreis com 40.000 células A459 a uma densidade de 100 microliters por poço.
Incubar a placa a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% durante a noite. Para preparar a diluição do soro no segundo dia, descongele primeiro as amostras de soro de referência e soro humanos a temperatura ambiente. Em seguida, coloque-os em um banho de água a 56 graus Celsius por 30 minutos para aquecê-los e ativá-los.
Em seguida, prepare mais de 110 microliters de uma diluição de um a 100 do soro de referência misturando 1,5 microliters do soro de referência com mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a um volume final de 150 microliters. Pipeta 110 microliters desta diluição em bem A12 de uma placa estéril de fundo U de 96 poços. Para fazer diluições de série de um a duas na placa, adicione primeiro 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina aos poços B12 a H12.
Em seguida, com uma nova transferência de ponta 55 microliters de bem A12 para bem B12. Pipeta para cima e para baixo cinco vezes para misturar a solução, e continuar até chegar bem H12. Pipeta fora do excesso de 55 microliters da solução do poço H12.
Em seguida, prepare uma diluição de 1 a 100 amostras de teste de soro e adicione 110 microliters de cada diluição aos poços correspondentes A1 a A9 e E1 a E9 da placa estéril de 96 poços. Em seguida, adicione 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a poços nas colunas de um a nove. Faça diluições de série de um a dois da linha A para a linha D e da linha E para a linha H como descrito anteriormente.
Adicione 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a poços nas colunas 10 e 11. Para preparar o estoque do vírus, primeiro coloque um frasco congelado de RSV em um banho de água de 37 graus Celsius para descongelá-lo rapidamente, em seguida, coloque o frasco no gelo. Em seguida, adicione o vírus à mídia DMEM contendo mistura penicilina-estreptomicina a aproximadamente 200 PFU por poço para fazer um volume total de 55 mililitros para 100 poços.
Para preparar a mistura de soro do vírus, adicione primeiro 55 microliters do vírus diluído a todos os poços de colunas de uma a nove e poços de linhas E a H das colunas 10 e 11. Em seguida, adicione 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a todos os poços das linhas A a D das colunas 10 e 11, e incubar a placa a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% por uma hora. Antes da inoculação de células A549 com RSV, examine a placa celular sob um microscópio leve para confirmar que as monocamadas celulares A549 são 80% confluentes.
Em seguida, inverta a placa suavemente para descartar a mídia, e levemente borrar a placa em uma toalha de papel absorvente estéril. Depois de cada um, lave com PBS estéril filtrado. Em seguida, adicione 100 microliters por poço da mistura de soro do vírus aos poços correspondentes na placa celular A549 de acordo com o modelo de placa fornecido no manuscrito, e incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma hora.
Ao final da incubação, use uma pipeta para remover 90 microliters por poço, e adicione 100 microliters da mídia contendo 1XM199, 1,5% CMC e 2% FCS na mistura Penicilina-Estreptomicina. Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por três dias. Para corrigir e desenvolver uma placa de ensaio, primeiro inverta a placa celular A549 infectada pelo RSV suavemente para descartar a mídia que contém M199, CMC, 2%FCS e penicilina-estreptomicina.
Em seguida, adicione lentamente 200 microliters de Buffer de Fixação a cada poço. Incubar a placa a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, descarte o tampão de fixação e limpe suavemente uma toalha de papel absorvente.
Deixe a placa de frente para baixo para secar por 10 minutos. Em seguida, com tampão PBS filtrado contendo 05 polisorbato 20, faça 5% de solução de bloqueio de leite. Adicione 200 microliters da solução de bloqueio a cada poço e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos.
No final da incubação inverta a placa suavemente para descartar a solução e borrar em uma toalha de papel absorvente. Para fazer o anticorpo primário, diluir um a 500 anticorpos XRSV de cabra na solução de bloqueio. Adicione 50 microliters a cada poço e incubar a placa a 37 graus Celsius por uma hora.
Lave a placa três vezes com PBS-polisorbate filtrado. Em seguida, faça o anticorpo secundário diluindo de um a 5.000 Alexa Fluor anti-cabra imunoglobulina G na solução de bloqueio. Adicione 50 microliters a cada poço e incubar a 37 graus Celsius por uma hora.
Lave a placa cinco vezes com PBS-polisorbate filtrado. Para contar placas com um leitor de pontos automatizado, primeiro use uma placa de cultura de 96 poços não utilizado para colaborar com o instrumento inserindo as configurações de contagem no canal FITC. Em seguida, leia a placa celular, enrole-a em papel alumínio, e armazene-a a quatro graus Celsius.
Em seguida, verifique as imagens de poços para placas artefatosas ou monocamadas celulares rompidas, e exclua poços com monocamadas de células rompidas. O número médio de placas dos poços de controle sem soro foi calculado e utilizado para determinar o corte de neutralização de 50% que resultaria em 50% de inibição da atividade do vírus. A diluição recíproca do soro foi traçada no eixo x e o número de placas no eixo y de um gráfico semi-log de uma linha traçada entre os dois pontos.
Os títulos de neutralização de 50% das amostras de soro de teste foram diluições vermelhas e séricos com contagens imediatamente acima ou abaixo do valor de 50% dos poços de controle sem soro foram identificados. Ensaios da RSVAPRN em duas coortes adultas diferentes da Gâmbia e voluntários saudáveis em Melbourne resultaram em adultos gambianos com uma média menor de 100 medíois em comparação com os adultos de Melbourne. O soro de referência rsv humano mostrado demonstra uma variabilidade muito baixa com o coeficiente de variação de 6,82%Este ensaio de neutralização de redução de placa RSV de alto rendimento pode ser facilmente implementado em muitos laboratórios, e apoiará o esforço internacional de harmonização da OMS para ensaios de anticorpos neutralizantes RSV.
Isso será fundamental para a avaliação dos novos candidatos à vacina RSV no futuro.
