xCELLigence análise celular em tempo real permite que você monitore quantitativamente a matança de células cancerosas por células imunes em condições livres de rótulos e ao longo de vários dias. Este sistema fornece um curso completo de tempo de morte de células cancerígenas alvo permitindo o rastreamento simultâneo de um grande número de construções, tipos de células efeitosoras ou terapias combinadas em relações de efeito baixo para razãos-alvo. Comece semeando 1,5 vezes 10 para as sete células HEK293FT no meio de cultura DMEM em um prato de cultura celular de 150 mililitros para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade.
Na manhã seguinte, misture 2,5 mililitros de solução de diluição de transfecção complementadas com cinco microgramas de DNA plasmídeo vetorial lentiviral e 22,5 microgramas de mistura de embalagens lentiviras com 82,5 microliters de reagente transfeccionário em 2,5 mililitros de solução de diluição de transfecção. Após uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, transfira a queda de reação para o prato das células HEK293FT e devolva as células à incubadora para uma segunda incubação durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o supernaente por 19 mililitros de meio de cultura DMEM fresco e devolva as células à incubadora durante a noite.
Colete o supernatante em um único tubo cônico de 50 mililitros para quatro graus Celsius de armazenamento pelos próximos dois dias antes de sedimentar o lentivírus por centrifugação na segunda manhã, a fim de remover quaisquer células ou detritos da solução. Transfira tudo menos cerca de um mililitro do lentivírus contendo supernadireção para um tubo de centrífuga ultra claro para ultracentrifugação. Após a ultracentrifugação, aspire cuidadosamente o vírus residual contendo supernascer, adicione suavemente 100 microliters de DMEM à pelota e coloque o tubo no gelo por 15 minutos.
No final da incubação, misture a solução suavemente e aliquotar a solução de lentivírus em tubos estéreis pré-refrigerados para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Em seguida, determine o título do lentivírus por RT-PCR quantitativo de acordo com as instruções do fabricante. Para geração e expansão de células CAR-T, ative de uma a duas vezes 10 às seis células mononucleares de sangue periféricos em um mililitro de célula CAR-T com um número igual de microesferas revestidas de CD3/CD28 em um poço de uma placa de 24 poços na incubadora de cultura celular por 24 horas.
Nas duas manhãs seguintes, misture um microliter de agente de melhorador de transdução com as células seguido pela adição de lentivírus em uma multiplicidade de infecção de cinco para um. Monitore o crescimento da célula T a cada dois ou três dias adicionando meio celular CAR-T fresco, conforme necessário, para manter as células de uma a duas vezes 10 às seis células por concentração mililitro. Para detectar a expressão CAR da célula T por citometria de fluxo, transfira três vezes 10 para o quinto CAR e células T não transduzidas em tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro.
Colete as células por centrifugação e resuspenja as pelotas em 200 microliters de tampão FACS suplementados com soro 1% humano. Divida cada amostra celular em 100 alíquotas de microliter em tubos individuais de poliestireno facs em gelo. Após cinco minutos, adicione um microliter de fragmentos FAB2 biotinilados de anti-rato de cabra FAB2 a um tubo de cada tipo de célula e dois microliters de anticorpo anti-tag rotulado pe ao outro tubo de cada tipo de célula com mistura completa.
Após 30 minutos no gelo, lave as células com três mililitros de tampão FACS fresco e depois de centrifugar decantar os supernantes. Resuspenja as pelotas no supernascer restante e adicione dois microliters de APC anti-CD3 e dois microliters de 7-AAD em cada tubo. Adicione um microliter de Streptavidin rotulado como PE com uma breve mistura ao tubo manchado com anticorpo anti-FAB2 e incubar todos os tubos no gelo por 30 minutos.
No final da incubação, analise as células por citometria de fluxo de acordo com protocolos padrão que alimentam as células T por dispersão para a frente versus dispersão lateral e expressão CD3 versus 7-AAD. Para um ensaio de potência de citolise em tempo real, adicione 50 a 100 microliters de meio de cultura celular alvo a cada poço de uma placa e e meça a impedância de fundo em um instrumento analisador de células. Detecte as células cancerígenas alvo da placa de cultura usando trippsina.
Lave as células em 15 mililitros de cultura fresca média e centrífuga. Resuspenda a pelota de célula cancerígena em cinco mililitros de meio fresco para contar e ajustar a densidade celular à concentração celular alvo apropriada. Adicione as células ao número apropriado de poços e deixe a placa e por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que as células se acomodem uniformemente na parte inferior dos poços.
Ao final do período de equilíbrio, coloque a placa no analisador de células em tempo real e inicie a medição da impedância automaticamente a cada 15 minutos durante a noite. A adesão e a proliferação das células-alvo podem ser rastreadas em tempo real. Na manhã seguinte, diluir o CAR do efeito e controlar as células T à concentração adequada em tubos individuais e remover 50 a 100 microlitros de cada poço da placa e de modo que o volume final em cada poço seja de 100 microlitros.
Em seguida, semee o efeito e controle células T nos poços apropriados no efeito apropriado para as razões-alvo em 100 microlitros de médio por poço. Em seguida, equilibre a placa e por 30 minutos à temperatura ambiente antes de retornar a placa ao sistema de analisador de células. Para medir a eficácia da célula T mediada pela morte das células cancerígenas alvo, monitore a morte mediada pelo CAR-T por 96 horas.
Cerca de 50% das células CAR-T mancharam positivo para anticorpo de fragmento de cadeia anti-única indicando a expressão do CAR em cerca de 50% das células T. Neste experimento representativo, foi utilizada uma razão de 10 para um efeito para o alvo para todos os grupos. Apenas células Raji e células CD22-CAR T tratadas células Raji mostraram mortes significativas em comparação com o controle apenas células T e grupos de células Mock CAR-T.
Neste experimento, apenas as células CD47-CAR-T foram eficazes na morte das células cancerígenas do pâncreas. Além disso, o sinal de impedância apenas das células CD47-CAR-T estava apenas ligeiramente acima do sinal de índice celular medido apenas nos poços médios indicando que o sinal de impedância resultante de células de suspensão, como células CAR-T, é mínimo e não contribui para o sinal de impedância geral quando as células CAR-T são adicionadas às células cancerígenas alvo. Notavelmente, o domínio co-estimulador do GITR foi observado como mais eficaz no aprimoramento da matança de células CAR-T contra células-alvo positivas do receptor do fator de crescimento epitelial em comparação com construções originais de CAR sem o domínio GITR.
O meio dos poços de placa e pode ser coletado para analisar o perfil da citocina nos pontos de tempo durante ou após o ensaio de acordo com as necessidades do experimento. No geral, a xCELLigence melhorou a eficiência de avaliar a potência de diversos imunoterápicos que vão desde engajadores bi-específicos de células T e vírus oncolíticos até inibidores de ponto de verificação imune em terapias combinadas.
