xCELLigence 실시간 세포 분석을 통해 라벨이 없는 조건하에서 여러 일 동안 면역 세포에 의한 암세포의 학살을 정량적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 시스템은 표적 암 세포 살해의 완전한 시간 과정을 제공하여 많은 수의 구조, 이펙터 세포 유형 또는 조합 요법을 낮은 이펙터에서 표적 비율에 동시 선별할 수 있도록 합니다. DMEM 배양 배지에 있는 7개의 HEK293FT 세포에 1.5배 10번 을 파종하여 150밀리리터 세포 배양 접시에 150밀리리터 세포 배양 접시에 37°C, 습도가 있는 이산화탄소 5%를 밤새 배양한다.
다음 아침, 렌티바이러스 벡터 플라스미드 DNA 5마이크로그램과 22.5 마이크로그램의 렌티바이러스 포장 믹스와 2.5 마이크로리터의 트랜스페션 용액 2.5 밀리리터를 혼합하여 2.5 밀리리터의 트랜스페션 희석용 액수를 혼합합니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후, HEK293FT 세포의 접시에 현명하게 반응 드롭을 전달하고 세포를 인큐베이터로 돌려 보내 두 번째 하룻밤 배양을 한다. 다음 날 아침, 상체를 신선한 DMEM 배양 배지의 19 밀리리터로 대체하고 세포를 하룻밤 동안 인큐베이터로 되돌려 보입니다.
용액에서 세포 나 이물질을 제거하기 위해 두 번째 아침에 원심 분리에 의해 렌즈 바이러스를 퇴적하기 전에 다음 이틀 동안 섭씨 4도 저장에 대한 단일 50 밀리리터 원모 튜브로 상체를 수집합니다. 초원심분리를 위한 초투명 원심분리기 튜브에 상피물질을 함유하는 렌티바이러스의 약 1밀리리터를 제외한 모든 것을 전송한다. 초원심분리 후, 수퍼나탄을 함유한 잔류 바이러스를 조심스럽게 흡인시키고, 100마이크로리터의 DMEM을 펠릿에 부드럽게 넣고, 튜브를 얼음 위에 15분간 놓습니다.
인큐베이션이 끝나면 용액을 부드럽게 섞고 렌티바이러스 용액을 영하 80도의 저장을 위해 미리 냉장된 멸균 튜브에 알리쿼트합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 정량적인 RT-PCR에 의해 렌즈바이러스의 티터를 결정합니다. CAR-T 세포 발생 및 확장을 위해, 24시간 동안 세포 배양배기에서 24웰 플레이트의 1웰에 동일한 수의 CD3/CD28 코팅 마이크로비드를 가진 CAR-T 세포 배지의 1밀리리터에서 6개의 말초 혈액 단핵 세포에 1-2배 10을 활성화한다.
다음 2 일 아침, 세포와 트랜스 듀스 증강 제의 하나의 마이크로 리터를 혼합 한 다음 5 대 1의 감염의 복합성에 렌티 바이러스의 추가. T 세포 성장을 모니터링하는 것은 밀리리터 농도당 6세포에 1~2회 10회 10회에서 세포를 유지하기 위해 필요에 따라 신선한 CAR-T 세포 배지를 추가하는 새로운 CAR-T 세포 배지를 추가한다. 유동 세포측정에 의한 T 세포 CAR 발현을 검출하기 위해, 개별 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 3회 10회 및 비변환T 세포를 전송한다.
원심분리에 의해 세포를 수집하고 1%인간 혈청으로 보충된 FACS 버퍼의 200 마이크로리터에서 펠릿을 재보페수한다. 각 세포 샘플을 얼음 위에 있는 개별 5밀리리터 폴리스티렌 FACS 튜브에 있는 100 마이크로리터 알리코크로 분할합니다. 5분 후, 염소 항마우스 FAB2의 생체분해된 FAB2 단편 1개와 각 세포 유형의 1개 튜브에 추가, PE 라벨이 부착된 안티태그 항체 2개를 각 세포 유형의 다른 튜브에 철저한 혼합을 한다.
얼음에 30 분 후, 신선한 FACS 버퍼의 세 밀리리터와 원심 분리 후 슈퍼 나티츠를 씻어. 나머지 상체에서 펠릿을 다시 중단하고 각 튜브에 APC 안티 CD3의 2 개의 마이크로 리터와 7-AAD의 2 개의 마이크로 리터를 추가합니다. PE 라벨이 부착된 스트렙타비딘 의 마이크로리터 1개를 안티 FAB2 항체로 염색한 튜브에 간략하게 혼합하고 얼음에 있는 모든 튜브를 30분 동안 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, T 세포를 전진 분산및 CD3 대 7-AAD 발현에 의해 T 세포를 게이팅하는 표준 프로토콜에 따라 세포측정을 유동하여 세포를 분석한다. 실시간 세포분석 효능 분석의 경우, 50~100마이크로리터의 표적 세포 배양 배지를 전자플레이트의 각 웰에 추가하고 세포 분석기 기기에서 배경 임피던스를 측정한다. 트립신을 사용하여 배양 플레이트에서 표적 암세포를 검출한다.
신선한 배양 배지와 원심분리기의 15 밀리리터에서 세포를 씻으시다. 계산을 위한 신선한 배지의 5밀리리터에서 암세포 펠릿을 재중단하고 적절한 표적 세포 농도로 세포 밀도를 조절한다. 적절한 수의 우물에 세포를 추가하고 실온에서 30 분 동안 전자 플레이트를 두어 세포가 우물 바닥에 균등하게 정착 할 수 있습니다.
평형 기간이 끝나면 플레이트를 실시간 셀 분석기에 배치하고 밤새 15분마다 자동으로 임피던스 측정을 시작합니다. 표적 세포의 접착 및 증식은 실시간으로 추적될 수 있다. 다음 날 아침, 이펙터 CAR를 희석하고 T 세포를 개별 튜브의 적절한 농도로 희석하고 각 웰의 최종 부피가 100 마이크로리터되도록 전자 플레이트의 각 우물에서 50~100 마이크로리터를 제거합니다.
다음으로, 이펙터 및 제어 T 세포를 적절한 이펙터에서 적절한 이펙터에서 100 마이크로리터당 중간 크기의 마이크로리터에서 표적 비율로 조절한다. 그런 다음 전자 플레이트를 실온에서 30분 동안 상위화한 후 플레이트를 셀 분석기 시스템으로 되돌린다. 표적 암세포의 T 세포 중재 살인의 효능을 측정하기 위해 CAR-T 중재된 살인을 96시간 동안 모니터링한다.
CAR-T 세포의 약 50%는 T 세포의 약 50%에서 CAR의 발현을 나타내는 항단 사슬 가변 단편 항체에 대해 양성으로 염색하였다. 본 대표적인 실험에서는 모든 그룹에 대해 10 대 1의 대상 비가 사용되었다. 라지 세포만 및 CD22-CAR T 세포 처리 라지 세포는 대조군 T 세포 와 모의 CAR-T 세포 그룹에 비해 상당한 살인을 나타냈다.
이 실험에서는 CD47-CAR-T 세포만이 췌장암세포를 죽이는 데 효과적이었다. 또한, CD47-CAR-T 세포로부터의 임피던스 신호만으로도 CAR-T 세포와 같은 현탁세포로부터 발생하는 임피던스 신호가 최소화되고 CAR-T 세포가 표적 암세포에 첨가될 때 전체 임피던스 신호에 기여하지 않는다는 것을 나타내는 배지 단독으로 측정된 세포 지수 신호보다 약간 높았습니다. 특히, GITR 공동 자극 도메인은 GITR 도메인이 없는 원래 CAR 구조에 비해 상피 성장 인자 수용체 양성 표적 세포에 비해 CAR-T 세포 를 죽이는 향상시키는 데 더 효과적인 것으로 관찰되었다.
전자 플레이트 우물로부터의 배지는 실험의 요구에 따라 분석 중 또는 이후에 시토카인 프로파일을 시간 지점에서 분석하기 위해 수집될 수 있다. 전반적으로 xCELLigence는 이중 특이적 T 세포 종사자 및 온연성 바이러스에서 부터 조합 요법의 면역 체크 포인트 억제제에 이르기까지 다양한 면역 요법의 효능을 평가하는 효율성을 향상시켰습니다.
