Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da imunoterapia sobre a avaliação da citotoxicidade das células imunes contra células tumorais de estrutura 3D. As principais vantagens deste método são que ele é simples e combina tecnologia avançada de imagem e um ensaio imunológico sensível. Comece lavando a linha de interesse das células cancerígenas colorretais com cinco mililitros de PBS e removendo as células do fundo do frasco com 0,5 mililitros de trippsina por cinco minutos a 37 graus Celsius.
Após confirmar o desprendimento sob um microscópio, neutralize a enzima de dissociação celular com 10 mililitros de meio completo e colete as células por centrifugação. Resuspend a pelota em cinco mililitros de meio fresco completo para contagem e resuspensar as células a uma concentração de 1,5 vezes 10 para a terceira células por concentração mililitro. Em seguida, semente 200 microliters de células em cada poço de 96 poços de placa de fundo redondo e coloque a placa em um aparelho de imagem automatizado dentro de uma incubadora Celsius de 37 graus com 5%de CO2 e 95% de umidade.
Faça login no software de aquisição do aparelho e selecione Agendar para Adquirir, Lançar Adicionar Embarcação, Digitalizar no Cronograma e Criar Embarcação Nova. Em seguida, selecione o tipo de varredura Spheroid e selecione os canais de interesse apropriados de campo brilhante e fluorescência. Defina a ampliação em 10 vezes e selecione o modelo da placa e sua posição dentro da gaveta do aparelho de imagem.
Selecione a posição dos poços a serem imagens e digite a descrição do experimento, incluindo o nome, o tipo de células e o número de células. Para a configuração de análise, selecione Analisar deferimento até mais tarde, clique com o botão direito do mouse na linha do tempo e selecione Definir intervalo de grupo de varredura selecionado e defina adicionar varreduras a cada quatro horas e para um total de 24 horas. Em seguida, defina o horário de partida para pelo menos uma hora após a incubação no aparelho de imagem automatizado.
Para verificar o progresso do crescimento esferoide, a cada dois dias, faça login no software de imagem e selecione Exibir varreduras recentes. Clique duas vezes no experimento de interesse e selecione Brightfield no painel Canais de imagem. Em seguida, use a ferramenta Measure Image Features para medir o diâmetro dos esferoides, adicionando 50 microlitros de meio completo por poço no quarto dia para limitar quaisquer efeitos médios de evaporação.
Quando os esferoides atingirem o tamanho experimental apropriado, angule cuidadosamente a placa e use uma pipeta multicanal para remover suavemente 150 microliters de meio completo de cada poço sem perturbar os esferoides. Em seguida, substitua o meio descartado por 50 microlitadores de uma solução de um a 200 de Anexo V Vermelho e coloque a placa em uma incubadora de cultura celular por 15 minutos. Centrífuga transduziu células CAR CD19 T em um tubo cônico de 15 mililitros e resuspenda a pelota em dois mililitros de meio completo.
Após a contagem, dilui as células para duas vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média completa. Em seguida, adicione 100 microliters de células CAR CD19 T a cada poço contendo esferoides e devolva a placa ao aparelho de imagem automatizado. No software de aquisição, selecione Agendar para Adquirir e clique com o botão direito do mouse na linha do tempo da varredura.
Selecione Editar linha do tempo e clique com o botão direito do mouse no grupo de varredura para excluí-lo. Clique com o botão direito do mouse na linha do tempo novamente e selecione Definir intervalo de grupo de varredura selecionado e definir Adicionar varreduras a cada 1 hora e meia e para um total de 24 horas. Em seguida, defina a hora de início da imagem para pelo menos uma hora após o início da incubação no aparelho de imagem automatizado e selecione Salvar varreduras de agendamento.
Para análise automatizada de imagens, no software de varredura, selecione Exibir varreduras recentes e análise de lançamento. Selecione Criar nova definição de análise e tipo de análise Spheroid e definir os canais de imagem a serem analisados. Selecione pelo menos 10 imagens representativas e visualize o procedimento de análise padrão em toda a pilha de imagens.
Modifique os parâmetros para a máscara de campo brilhante e visualize a pilha de imagens, confirmando que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão. Modifique os parâmetros para máscara verde e visualize a pilha de imagens para confirmar que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão. Modifique os parâmetros para máscara vermelha e visualize a pilha de imagens para confirmar que os parâmetros selecionados detectam os esferoides com precisão.
Tome cuidado para obter o melhor sinal sobre ruído e sensibilidade sobre as relações de especificidade, tendo em mente que você não será capaz de encontrar um conjunto de parâmetros que permitirá capturar cada evento em cada ponto de tempo. Em seguida, lance o analisador. Quando a análise estiver concluída, extraia a medição de interesse e selecione o arquivo analisado e a opção métricas de gráfico.
Selecione as métricas de interesse, a varredura e o poço. Clique em Exportar dados para extrair as métricas selecionadas em vários formatos de arquivo. Em seguida, para extrair as imagens, selecione o arquivo analisado e selecione Exportar Imagens e Filmes.
A expressão CAR CD19 em células T transduzidas e a expressão CD19 em células cancerígenas colorretais transduzidas podem ser confirmadas por citometria de fluxo. Aqui, o resultado de um típico experimento esferoide pode ser observado. Ao contrário das células T simuladas, as células CD19 CAR T são capazes de matar especificamente os esferoides derivados da linha de células cancerígenas colorretais, diminuindo consideravelmente o número de células tumorais vivas.
O rastreamento da evolução dos sinais totais verdes e vermelhos dentro dos limites esferoides ao longo do tempo revela que logo após a injeção de células CAR T cd19, o tamanho dos esferoides diminui rapidamente à medida que o sinal de apoptose aumenta rapidamente. Após este procedimento, outros métodos como ensaios de toxicidade, ensaios de migração celular ou medidas de estrutura esferoide podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre rastreamento de drogas, motilidade celular T ou formação de spheroid, respectivamente.
