xCELLigence analyse cellulaire en temps réel vous permet de surveiller quantitativement l’abattage des cellules cancéreuses par des cellules immunitaires dans des conditions sans étiquette et au cours de plusieurs jours. Ce système fournit un cours complet de temps de tuer des cellules cancéreuses cibles permettant le criblage simultané d’un grand nombre de constructions, types de cellules effectrices, ou thérapies combinées à de faibles ratios effecteur/cible. Commencez par ensemencement 1,5 fois 10 aux sept cellules HEK293FT dans le milieu de culture DMEM dans un plat de culture cellulaire de 150 millilitres pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec humidité.
Le lendemain matin, mélanger 2,5 millilitres de solution de dilution transfection complétée par cinq microgrammes d’ADN plasmide vecteur lentiviral et 22,5 microgrammes de mélange d’emballage lentiviral avec 82,5 microlitres de réaccente transfection dans 2,5 millilitres de solution de dilution transfection. Après une incubation de 15 minutes à température ambiante, transférer la chute de réaction sage dans le plat des cellules HEK293FT et retourner les cellules à l’incubateur pour une deuxième incubation d’une nuit. Le lendemain matin, remplacez le supernatant par 19 millilitres de milieu de culture DMEM frais et retournez les cellules à l’incubateur pendant la nuit.
Recueillir le supernatant dans un seul tube conique de 50 millilitres pour un stockage de quatre degrés Celsius pendant les deux prochains jours avant de sédimenter le lentivirus par centrifugation le deuxième matin afin d’éliminer les cellules ou les débris de la solution. Transférer tout sauf environ un millilitre du lentivirus contenant du supernatant dans un tube de centrifugeuse ultra clair pour une ultracentrifugation. Après l’ultracentrifugation, aspirez soigneusement le virus résiduel contenant du supernatant, ajoutez doucement 100 microlitres de DMEM à la pastille et placez le tube sur la glace pendant 15 minutes.
À la fin de l’incubation, mélanger délicatement la solution et aliquot la solution de lentivirus en tubes stériles pré-réfrigérés pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Déterminez ensuite le titer du lentivirus par RT-PCR quantitatif selon les instructions du fabricant. Pour la génération et l’expansion des cellules CAR-T, activez une à deux fois 10 des six cellules mononucléaires périphériques du sang dans un millilitre de milieu cellulaire CAR-T avec un nombre égal de microbilles enduites de CD3/CD28 dans un puits d’une plaque de 24 puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.
Les deux matins suivants, mélanger un microlitre d’agent exhausteur de transduction avec les cellules suivie de l’ajout de lentivirus à une multiplicité d’infection de cinq à un. Surveillez la croissance des cellules T tous les deux à trois jours en ajoutant un milieu de cellule CAR-T frais au besoin pour maintenir les cellules à une à deux fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre. Pour détecter l’expression de la RCA à cellule T par cytométrie d’écoulement, transférez trois fois 10 à la cinquième CAR et les lymphocytes T non transduced dans des tubes de microcentrifugeuse individuels de 1,5 millilitre.
Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre les granulés dans 200 microlitres de tampon FACS complété par 1% sérum humain. Divisez chaque échantillon cellulaire en aliquots de 100 microlitres dans des tubes facs en polystyrène de cinq millilitres individuels sur la glace. Après cinq minutes, ajouter un microlitre de fragments fab2 biotinylés d’anti-souris de chèvre FAB2 à un tube de chaque type de cellule et deux microlitres d’anticorps anti-étiquettes étiquetés PE à l’autre tube de chaque type de cellule avec un mélange complet.
Après 30 minutes sur la glace, laver les cellules avec trois millilitres de tampon FACS frais et après centrifugage décanter les supernatants. Resuspendez les granulés dans le supernatant restant et ajoutez deux microlitres d’anti-CD3 APC et deux microlitres de 7-AAD à chaque tube. Ajouter un microlitre de Streptavidin étiqueté PE avec un bref mélange au tube taché d’anticorps anti-FAB2 et incuber tous les tubes sur la glace pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, analyser les cellules par cytométrie d’écoulement selon les protocoles standard s’entillonnant les lymphocytes T par dispersion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale et l’expression CD3 contre 7-AAD. Pour un essai de puissance de cytolyse en temps réel, ajoutez 50 à 100 microlitres de milieu de culture cellulaire cible à chaque puits d’une plaque électronique et mesurez l’impedance de fond dans un instrument d’analyseur cellulaire. Détecter les cellules cancéreuses cibles à partir de la plaque de culture à l’aide de trypsine.
Laver les cellules en 15 millilitres de culture fraîche moyenne et centrifugeuse. Resuspendez la pastille de cellules cancéreuses en cinq millilitres de milieu frais pour compter et ajuster la densité cellulaire à la concentration appropriée de cellules cibles. Ajouter les cellules au nombre approprié de puits et laisser la plaque électronique pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de s’installer uniformément sur le fond des puits.
À la fin de la période d’équilibrage, placez la plaque dans l’analyseur cellulaire en temps réel et lancez automatiquement la mesure de l’impédance toutes les 15 minutes pendant la nuit. L’adhérence et la prolifération des cellules cibles peuvent être suivies en temps réel. Le lendemain matin, diluer l’effecteur CAR et contrôler les cellules T à la concentration appropriée dans les tubes individuels et enlever 50 à 100 microlitres de chaque puits de la plaque électronique de sorte que le volume final dans chaque puits est de 100 microlitres.
Ensuite, ensemencer l’effecteur et contrôler les cellules T dans les puits appropriés à l’effecteur approprié par rapport aux ratios cible dans 100 microlitres de milieu par puits. Ensuite, équilibrer la plaque électronique pendant 30 minutes à température ambiante avant de retourner la plaque au système d’analyseur cellulaire. Pour mesurer l’efficacité du meurtre par la cellule T des cellules cancéreuses cibles, surveillez la mise à mort médiatisée du CAR-T pendant 96 heures.
Environ 50 % des cellules CAR-T ont été tachées de positif pour l’anticorps à fragment variable à chaîne unique indiquant l’expression de la RCA dans environ 50 % des cellules T. Dans cette expérience représentative, un rapport effecteur/cible de 10 pour un a été utilisé pour tous les groupes. Les cellules Raji seulement et les cellules T CD22-CAR traitées par cellule Raji présentaient des pertes significatives par rapport à la cellule T de contrôle seulement et aux groupes de cellules MOCK CAR-T.
Dans cette expérience, seules les cellules CD47-CAR-T étaient efficaces pour tuer les cellules cancéreuses pancréatiques. En outre, le signal d’impédance des cellules CD47-CAR-T seules n’était que légèrement supérieur au signal de l’indice cellulaire mesuré dans les puits moyens seuls, ce qui indique que le signal d’impédance résultant des cellules de suspension telles que les cellules CAR-T est minime et ne contribue pas au signal d’impédance global lorsque les cellules CAR-T sont ajoutées aux cellules cancéreuses cibles. Il est à noter que le domaine de la costimulation gitr a été observé pour être plus efficace dans l’amélioration de la mise à mort des cellules CAR-T contre les cellules cibles positives du récepteur du facteur de croissance épithéliale par rapport aux constructions car originales sans le domaine GITR.
Le milieu des puits de plaques électroniques peut être collecté pour analyser le profil de cytokine à des moments où il y a lieu pendant ou après l’analyse en fonction des besoins de l’expérience. Dans l’ensemble, xCELLigence a amélioré l’efficacité de l’évaluation de la puissance de diverses immunothérapies allant des engageurs de cellules T bi-spécifiques et des virus oncolytiques aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaire dans les thérapies combinées.
