Name: informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens
Uploaded: 2018-06-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e pelo NSF Grant de projeto de pesquisa: 1517110.

1. mapeamento de arquivos de Fastq
Nota: DEEPN software, bem como muitos programas de Bioinformática usam dados de sequência de DNA onde cada sequência ler foi mapeada para a sua posição em referência DNA. Uma variedade de programas de mapeamento pode ser usada para esta incluindo a interface MAPster aqui que usa o programa HISTAT2 para produzir arquivos Sam usados em etapas subsequentes.
<ol><li>Mapear os dados de sequência para a versão correta do genoma. Para bibliotecas de Y2H de origem do mouse, use o genoma de mm10 UCSC; para aqueles que utilizam os genes humanos, uso o genoma de referência UCSC hg38, para genes de Saccharomyces cerevisiae , o genoma de referência de UCSC SacCer3.</li>
	<li>
Instale o MAPster.
	<ol>
<li>Baixar software MAPster e instalar. O software pode ser encontrado usando um navegador da web para o seguinte: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 é executado em sistemas baseados em Unix como um Apple Macintosh. Por causa disso, o programa MAPster só vai funcionar em sistemas compatíveis, como o Apple Macintosh e linux. Nota: Requisitos do sistema para um Mac da Apple são: OSX 10,10 +, > 4 Gb de RAM, > 500 Gb de espaço em disco e acesso à internet para download de genomas de referência. Os usuários podem precisar de o consultar com um institucional pessoa se sua empresa tem protocolos de segurança Restringindo permissões e direitos de administrador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Insira arquivos necessários e parâmetros através da guia "Main" (Figura 1). Selecione o botão "Pairwise" apropriado para inserir arquivos ou como pares ou não pareado com FASTQ como o formato de arquivo padrão.
	<ol>
<li>Para análise DEEPN, ativar a opção de "Pairwise" para "Off" para ser executado em um único formato de leitura.</li>
		<li>Carregar arquivos em MAPster bastando arrastar-e-soltar para a janela apropriada.</li>
		<li>Selecione uma fonte de DNA/genoma que corresponde à fonte das pastilhas Y2H rapina biblioteca de referência. Indexado genomas de diversos organismos modelo são listadas na caixa "Genoma" e podem ser automaticamente baixadas da Johns Hopkins University Center for Computational Biology. Genomas de referência serão armazenadas localmente para uso posterior.</li>
		<li>Indica o número de processos do computador para ser dedicado ao programa de mapeamento sob a caixa de "Threads", desde HISAT2 suporta multi-threading. MAPster irá Pesquisar o computador e sugerir o número máximo de processadores disponíveis por padrão.</li>
		<li>Especifique um nome de arquivo de saída. Este nome de arquivo será usado durante todo o processo DEEPN então recomenda-se um nome curto mas descritivo sem espaço ou caracteres especiais. Especifique uma pasta para os arquivos mapeados usando o botão "Abrir pasta de saida" de saída.</li>
		<li>Uma vez que os arquivos apropriados e parâmetros foram selecionados, adicione o trabalho de mapeamento para a fila de trabalhos usando o botão "Adicionar a fila". Os nomes de arquivo na janela principal podem ser eliminados e substituídos com os arquivos correspondentes a uma nova amostra e podem ser adicionados para a fila depois de fornecer um nome de arquivo de saída correspondente.</li>
		<li>Clique no botão "Executar fila", uma vez que todos os trabalhos são inseridos na fila de trabalho. Nota: Uma vez que um trabalho de mapeamento foi colocado na fila, selecionar esse trabalho faz com que as configurações de parâmetro a ser exibido na janela "Parâmetros de trabalho" e a instrução de linha de comando com todos os argumentos para ser exibido na janela do "Comando de trabalho". As opções de saída incluem dirigindo-se a manter leituras que não conseguem alinhar e especificando o número de alinhamentos primários permitidos para cada leitura. O arquivo de saída padrão de MAPster é em formato de SAM (por exemplo, um arquivo de 'Sam'). Ele conterá todas as leituras de sequência de arquivos fastq especificado para aquela amostra, incluindo aqueles que foram (mapeado) e não foram mapeadas com sucesso para o especificado geome (desmapeadas).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic processamento usando Software DEEPN
Nota: Software de DEEPN atualmente é compilado para uso com bibliotecas de rapina contendo sequências de cDNA de rato, sequências de cDNA humano ou sequências de DNA genômicas de S. cerevisiae . DEEPN aceita o formato de arquivo padrão Sam e pode aceitar um arquivo SAM (Sam) contendo leituras mapeadas e não mapeadas ou arquivos separados para cada um do lê não mapeado e mapeado.
<ol><li>Download de software DEEPN e instalar. O software pode ser encontrado usando um navegador da web para o seguinte: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Selecione qual versão corresponde a plataforma de computação e o descarregamento. Para instalar, abra o pacote de instalação baixado. Nota: As versões do DEEPN estão disponíveis para PC, Mac e Linux sysrems. Devem ter sistemas Mac e PC > espaço no disco rígido de 500 Gb e > 4 Gb de RAM.</li>
	<li>
Abra o software DEEPN. Selecione as informações de biblioteca de rapina correspondente da caixa de seleção superior a janela principal (Figura 2). Selecione uma pasta onde os arquivos processados podem ir clicando no botão "Pasta de trabalho" e navegando para a pasta/diretório. Uma pessoa pode criar um novo pasta/diretório se necessário. Uma vez que uma "pasta de trabalho" está selecionada, DEEPN criará três subpastas, intitulado unmapped_sam_files, mapped_sam_files e sam_files.
	<ol>
<li>Se usando arquivos Sam contendo leituras mapeadas e não mapeadas, tais como aqueles produzidos com as configurações padrão do programa MAPster, coloque-os na pasta 'sam_files'. Caso contrário coloque arquivos Sam no unmapped_sam_files e mapped_sam_files em conformidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicie o processamento clicando no botão "Gene Count + junção fazer". Nota: O processamento começará com o módulo de contagem de Gene que usará as posições de mapeamento para contar quantas leituras correspondem a cada gene. Make de junção, em seguida, extrair sequências de junção (as sequências fundiram diretamente a jusante do domínio de Gal4-ativação) do lê e identificá-los usando o algoritmo de explosão. Isto irá criar um conjunto de pastas retratado na Figura 3. Tempo de processamento depende do tamanho e número de sequência de arquivos de dados e velocidade de processamento do computador usado. Lê vezes típicas variam de 12 a 30 h para um conjunto de dados experimental de 250 milhões. O procedimento de Gene contagem e o procedimento Junction_Make podem ser iniciados individualmente clicando no botão "Gene contagem" ou o botão "Fazer junção".</li>
	<li>
Baixe e instale o Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Este é um pacote de análise estatística, projetado para conjuntos de dados DEEPN que atualmente só funciona em sistemas Unix Mac.
	<ol>
<li>Abra Stat_Maker e clique no botão "Verificar a instalação" (Figura 4). Se executando pela primeira vez, Stat_Maker instalará automaticamente R, JAGS e Bioconductor puxando esses recursos da internet. Uma vez que R e JAGS Bioconductor são detectados, Stat_Maker se tornará ativo e permitir a entrada do usuário.</li>
		<li>Clique no botão "Escolher pasta" para navegar até a pasta de trabalho que DEEPN processado. Stat_Maker automaticamente encontrar e listar os arquivos para a análise estatística na janela.</li>
		<li>Arraste e solte os arquivos apropriados da janela de lista de arquivo acima no windows arquivo abaixo para cada conjunto de dados vetoriais e isca e para cada condições de crescimento: não selecionado (a + mídia) e selecionado (a mídia). Importante, Stat_Maker requer conjuntos de dados duplicados para vazio vector em paz, duas amostras de populações não selecionadas e duas amostras de selecionado. Isto dá uma estimativa de variabilidade dentro do experimento.</li>
		<li>Clique no botão "Executar". Dependendo da velocidade do computador, computação levará entre 5 a 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rever os resultados da saída do Stat_Maker, que são colocados em uma nova subpasta dentro da pasta de trabalho principal rotulada "Stat_Maker resultados". Nota: Os resultados são encontrados em um arquivo CSV (valores separados por vírgula) que pode ser aberto, em comum, programas de planilha eletrônica. Stat_Maker irá classificar hits de gene que são susceptíveis de ser diferencialmente enriquecida em seleção com a isca de interesse sobre o vazio pTEF-GBD (Figura 5). Também tabulados é a percentagem de leituras para cada conjunto de dados onde a inserção do gene encontra-se a montante, a jusante, ou dentro do frame de leitura aberto e se o gene também é encontrado dentro do quadro de leitura correta de translação. Muitas vezes, DEEPN irá capturar robustas interações Y2H de uma isca com porções de um cDNA dado que são fora do quadro de leitura adequada da proteína correspondente ou a uma parte do cDNA que está a jusante do seu quadro de leitura aberta correspondente. A saída combinada de Stat_Maker de digitalização agiliza deteção e eliminação destes sucessos irrelevantes.</li>
	<li>
Para rever os dados sobre cada candidato em potencial, abra o software DEEPN, selecione as informações de biblioteca de rapina correspondente e, em seguida, a pasta de trabalho correto usando a "pasta de trabalho".
	<ol>
<li>Clique no botão "Consulta de explosão". Isso carrega uma nova janela (Figura 6). Na caixa de texto superior, digite o nome do gene ou o número do GenBank NM para selecionar o gene candidato de interesse. Esses nomes de gene correspondem aos nomes listados no arquivo de saída de StatMaker. Tipo entrar ou retornar, que inicia a recuperação do gene de interesse.</li>
		<li>Selecione quais conjuntos de dados serão utilizados para a análise usando os menus "Selecione Dataset". Normalmente, estes incluem o vetor somente e isca amostras crescidas sob condições não-seletivo e a amostra de isca cultivadas sob condições de seleção. Inicialmente, os conjuntos de dados irão levar alguns momentos para carregar, no entanto, a consulta subsequentes dos mesmos conjuntos de dados com genes diferentes vai rapidamente. Blast_Query irá exibir os pontos de fusão junto a sequência de interesse e abundante como cada ponto de fusão é. Isto pode ser exibido em um formato gráfico usando a guia de "Conspiração" ou um formato de tabela, usando a guia "Resultados". Estes resultados podem ser exportados para um arquivo. csv, clicando no botão "Salvar. csv" no canto superior direito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. verificação de candidatos identificados por DEEPN
Nota: O propósito de DEEPN e Stat_Maker é identificar genes candidatos que dão uma interação positiva de Y2H. Verificar tais interações de Y2H pode ser feito usando um formato tradicional de Y2H binário usando o plasmídeo isca de interesse emparelhado com o plasmídeo de rapina' domínio' Gal4-ativação vazio bem como emparelhado com o plasmídeo de rapina carregando o fragmento do gene/do cDNA de interesse. Não é viável para isolar o plasmídeo real de interesse dentro da mistura de DNA isolado da população de leveduras submetida a seleção Y2H. No entanto, um pode computacionalmente reconstruir o que o fragmento do gene/cDNA é que produz a interação Y2H, projetar primers para a 5' e 3' extremidades desse fragmento e amplificar o fragmento de DNA isolado da população de leveduras. Esta seção descreve como localizar a extremidade 5' e 3' do fragmento de rapina do candidato.
<ol><li>Abra o software DEEPN e escolher os parâmetros "Parâmetro Select" e a pasta de trabalho "Selecione trabalho pasta" correspondente ao projeto. Lançar o módulo Blast_Query clicando no botão "Consulta de explosão".</li>
	<li>
Digite o nome do gene de interesse ou sua GenBank "NM" número na caixa de texto superior. Selecione o menu pull-down do conjunto de dados que corresponde à população levedura selecionada para a isca de interesse para recuperar a tabela de posições da junção na aba 'Resultados'. Por padrão, Blast_Query requisitará as diferentes posições de acordo com a sua abundância no dataset, quantificada pelo ppm do número total dos cruzamentos encontrados dentro do banco de dados.
	<ol>
<li>Encontrar uma posição da mais abundante, que é "no ORF" e "no quadro". O valor de posição corresponde à posição de nucleotídeos do gene com a sequência de referência NCBI (número de 'NM') encontrada na caixa de texto superior. Essa sequência pode ser Obtida de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) ou copiada da caixa de texto inferior na janela Blast_Query. Nota: Um exemplo pode ser encontrado na Figura 6, painel do meio. No centro conjunto de dados, os 'resultados' mostraram como a junção de mais abundante: 'Posição': 867; '#Junctions': 20033.821; 'Início da consulta', 1; CDS: No ORF; e 'Frame': no quadro. 867 de nucleótidos da sequência de referência NCBI GenBank NM_019648 é o início do fragmento de rapina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se começar a consulta for 1, desenha a extremidade 5' do primer para incluir o nucleotídeo correspondente ao número de posição e estender 25 nucleotídeos a jusante da posição (Figura 7). Se começar a consulta é mais do que 1, indica que há nucleotídeos extras entre o domínio de activação de Gal4 e a sequência de presas de interesse e que a primeira demão deve começar mais a jusante de acordo com o valor do início da consulta.</li>
	<li>Da janela DEEPN clique no botão de "Profundidade de leitura" sob "Analisar dados". Uma vez que a janela de leitura de profundidade é aberta, digite o NCBI referência sequência (NM) número ou gene nome na caixa de texto superior. Use o menu pull-down para selecionar o conjunto de dados relevante que contém o gene enriquecido de interesse. Utilize a tabela do lado esquerdo e os gráficos exibir à direita para determinar quantas leituras foram encontradas nos dados que correspondem ao gene de interesse (Figura 7-B).</li>
	<li>Desenha uma cartilha da extremidade 3' que irá capturar a sequência do fragmento do gene calculado pela profundidade de leitura. Se a abundância de leituras ultrapassa a ORF e pare de códon, desenha a primeira demão para que inclui o códon de parada e a região só montante do códon de parada. Se as sequências do gene não ultrapassam o codão stop, use a tabela de resultados para localizar a região 3' mais distante que pode ser detectada e use esta posição como o mais distante 3' posição para colocar o primer. Nota: O programa de leitura de profundidade verifica em intervalos para encontrar as sequências que correspondem o especificado gene/do cDNA de interesse. Isto ajuda a prever onde o final 5' e 3' do fragmento de rapina mais abundante é para esse gene na amostra. Flutuações na profundidade ao longo do comprimento da sequência de leitura são normais, como pode ser visto na Figura 7. Se a profundidade de leitura é claramente passado o códon de parada, ele indica que o fragmento de rapina se estende além do códon de parada e, portanto, o 3' primer pode simplesmente correspondem a região em torno do códon de parada.</li>
	<li>
Realize uma reação de PCR de 50 µ l por gene. Cada reação contém 25 pmol de cada primer frente e verso, combinando o plasmídeo de rapina-biblioteca (ver tabela de materiais). Reações também contem 25 µ l de alta-fidelidade 2 x PCR Master Mix, 5 µ g de amostra de DNA e a água até 50 µ l.
	<ol>
<li>Amplificar as reações para 25 ciclos com tempos de extensão de 3 min a 72 ° C, recozimento a temperatura de 55 ° C por 30 s e desnaturando a 98 ° C, durante 10 s. Precede a bicicleta por uma desnaturação s 30 a 98 ° C e siga com uma incubação de 5 min a 72 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+Next-Generation+Sequencing+Reads.">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar

O pacote de software aqui descrito permite completamente processar e analisar dados de sequenciamento de DNA de alto throughput de uma experiência de DEEPN. O primeiro programa usado é o MAPster, que leva as leituras de sequência de DNA em arquivos padrão fastq e mapas de sua posição para uma referência de DNA para processamento a jusante, por uma série de programas de informática, incluindo o software DEEPN. O utilitário da interface MAPster e sua capacidade de enfileirar vários trabalhos, combinar arquivos d...

Uma abordagem para descobrir as interações da proteína é o ensaio (Y2H) 2-híbrido do fermento, quais façanhas engenharia de células de levedura que crescem somente quando uma proteína de interesse vincula-se a um fragmento de uma interação sócio1. Deteção de múltiplas interações Y2H agora pode ser feita com a ajuda de sequenciamento de elevado-throughput maciço paralelo. Vários formatos foram descritas2,3,4,5 , incluindo uma que desenvolvemos onde as populações são cultivadas no lote sob condições que seleciona para levedura, que contém plasmídeos que produzem um positivos da interação do Y2H6. O fluxo de trabalho desenvolvido, denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteína), identifica o diferencial interactomes das bibliotecas de rapina mesmo para identificar as proteínas que interagem com uma proteína (ou domínio) vs. outra proteína ou um domínio mutante conformationally distinto. Um dos passos importantes para este fluxo de trabalho é adequado processamento e análise dos dados de sequenciamento de DNA. Algumas informações podem ser recolhidas contando apenas o número de leituras para cada gene antes e depois da seleção de interações Y2H de forma análoga a um experimento de RNA-seq. No entanto, informações muito mais detalhadas podem ser extraídas desses conjuntos de dados, incluindo informações sobre o subdomínio de uma determinada proteína que é capaz de produzir uma interação Y2H. Além disso, Considerando que a abordagem DEEPN é valiosa, analisar muitas repetições de amostra pode ser complicado e caro. Este problema é aliviado usando um modelo estatístico que foi desenvolvido especificamente para conjuntos de dados DEEPN onde o número de repetições é limitada6. Para fazer processamento e análise de conjuntos de dados de sequenciamento de DNA confiável, completo, robusto e acessível para os investigadores sem especialização bioinformática, desenvolvemos um conjunto de programas de software que cobrem todas as etapas de análise.
Esta suite de programas de software stand-alone que são executados em computadores desktop inclui MAPster, DEEPN e Stat_Maker. MAPster é uma interface gráfica de usuário que permite que cada arquivo de fastq na fila para mapear o genoma usando o programa HISAT27, produzindo um arquivo Sam padrão para uso em aplicações a jusante. DEEPN tem vários módulos. Ele atribui e conta leituras correspondentes a determinado gene semelhante a uma quantificação de RNA-seq tipo usando o módulo 'Gene contagem'. Também extrai as sequências correspondentes a junção entre o domínio transcriptional Gal4 e a sequência de rapina e agrupa a posição desses cruzamentos para permitir a sua inspecção pelos quadros comparativos e gráficos (usando o módulo 'Junction_Make') O módulo 'Blast_Query' permite fácil inspeção, quantificação e comparação de sequências de junção de Gal4 de junção. Stat_Maker avalia as leituras por dados de enriquecimento gene estatisticamente como uma maneira de priorizar provável Y2H sucessos. Aqui, descrevemos como usar esses programas de software e totalmente analisar dados de um Y2H DEEPN experimentar a sequência de DNA. Versões do DEEPN estão disponíveis para rodar em sistemas Linux, Mac e PC. Outros programas, como o programa de mapeamento MAPster e o módulo de estatísticas DEEPN Stat_Maker dependem de sub-rotinas que executado sob Unix e estão disponíveis apenas em sistemas Mac e linux.

<table><tbody><tr><td>Mapster</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td></tr><tr><td>DEEPN software</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Statmaker</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Minimum computer system</td><td>Apple</td><td></td><td>Mac Intel Core i5 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>OS 10.10 or higher</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td>Intel i5-7400 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>Windows 7 or higher</td></tr></tbody></table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Adaptámos o ensaio 2-híbrido de levedura para descobrir simultaneamente dezenas de interações proteína transitória e estático dentro de um único ecrã utilizando o sequenciamento de DNA do elevado-throughput curto-leitura. Os conjuntos de dados sequência resultante podem não só acompanhar que genes em uma população que são enriquecidos durante a selecção para interações de 2-híbrido de levedura positivas, mas também fornecem informações detalhadas sobre os subdomínios relevantes de proteínas suficientes para interação. Aqui, descrevemos um conjunto completo de programas de software stand-alone que permitem que não-especialistas para executar todas as bioinformática e estatísticos passos para processar e analisar arquivos de fastq de sequência de DNA de um ensaio de 2-híbrido do fermento de lote. As etapas de processamento abrangidas por estes programas incluem: 1) mapeamento e contagem leituras sequência correspondente a cada proteína candidato codificada dentro de uma biblioteca de rapina 2-híbrido do fermento; 2) um programa de análise estatística que avalia os perfis de enriquecimento; e 3) ferramentas para examinar o quadro translacional e posição dentro da região de codificação de cada enriquecido plasmídeo que codifica as proteínas interagindo de interesse.

Mapeamento de dados de fastq: o primeiro passo Em praticamente todas as aplicações de NGS incluindo DEEPN a saída inicial é um arquivo de leituras de pequena sequência deve ser mapeada pelo alinhamento de genômica, transcriptomic, ou outra referência de DNA8. Recentemente, o programa de alinhamento de HISAT2 foi desenvolvido que usa algoritmos de indexação de estado-da-arte para aumentar drasticamente a velocidade de mapeamento<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens at JoVE.com

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

7.1K visualizações.  University of Iowa. Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

Vídeo: Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Bioquímica

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genética

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imunologia e Infecção

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biologia

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Estudos de interação biomolecular usando a técnica de dois híbridos de levedura 

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

Autor em destaque: Isolamento aprimorado de mutantes de interação nula em levedura

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis meio de uma levedura Screen Two-hybrid