The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

NOTA: Os experimentos apresentados neste trabalho foram aprovados pelo conselho de ética da instituição, da Universidade de Dusseldorf. 1. Preparação exossomo <ol><li> Coletar sangue total em 3 tubos de citrato via punção venosa (total de 9 ml). Despeje o sangue para um tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifuga-se a amostra a 1500 xg durante 20 min a 4 ° C para iniciar a separação das células do plasma. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml Falcon. </li><li> Centrifuga-se a amostra a 2800 xg durante 20 min a 4 ° C para remover todas as células do plasma (plasma isento de células; PCP). Transfira o PCP a tubos de ultracentrifugação, 1 ml por tubo. </li><li> Centrifugar a 100.000 xg durante 90 min a 4 ° C para esgotar exossomas. Retirar 900 ul de sobrenadante. Re-suspender o pellet nos restantes 100 l no tubo de ultracentrifugação. Adicionar 900 ul de PBS. </li><li> Centrifugar novamente a 100.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Retirar 900 ul de supernatant. Re-suspender o pellet com as restantes 100 l. </li><li> Transferência de 5 a 20 ul de re-suspensão em 40 ml de água destilada. Filtra-se a suspensão através de um filtro de 450 nm para separar exossomas a partir de partículas maiores. Utilize este suspensão final para a medição de partículas. </li></ol> 2. Processo de inicialização do instrumento de rastreamento de partículas <ol><li> Inicie o programa clicando duas vezes sobre o ícone-software. Clique nas diversas guias de software (&quot;exame de celular&quot;, &quot;Medição&quot;, &quot;Análise&quot;) para alternar entre eles ao longo do protocolo. </li><li> Siga as instruções na tela para uma implementação automatizada do processo de inicialização. Marque as caixas de verificação de qualidade, tanto para celular e alinhamento automático. NOTA: Qualquer um desses passos podem ser repetidos em separado, se necessário, pressionando o botão (A) ou (B) na guia &quot;de seleção de células&quot;. </li><li> Abra a porta de entrada e de saída do instrumento de NTA e injectar 10 ml de água destilada através de uma seringa para dentro do canal de células através da abertura de entrada. Fechar o orifício de saída como a última quantidade de água está a ser injectado. Coloque um copo sob a porta de saída para recolher a solução para o lixo. Assegure-se que a célula de medição é livre de bolhas de ar e não seringa bolhas de ar no sistema. Fechar a porta de entrada imediatamente. </li><li> Realize a verificação da qualidade célula clicando em &quot;OK&quot;. O software irá exibir os resultados de qualidade de células depois de alguns segundos. </li><li> Se todas as partículas ainda são visualizados na tela de visualização ao vivo do software ou se o resultado da verificação de qualidade só é bom ou ruim, repita o passo 2.3 até que as partículas restantes são removidos da célula de medição. Também repita o passo 2.3 após cada medição para evitar acúmulo de partículas. Se repetir a injeção de água destilada e de seleção de células não produz um &quot;bom&quot; resultado, avance para 2.9. </li><li> Preparar uma suspensão de controlo contendo uniforme 200 nm pol sizedystyrene partículas a ser usada para alinhar os focos de laser e o microscópio. Adicionar uma gota de concentrado em suspensão, fornecida pelo fabricante do instrumento, a 500 ml de água destilada para se obter a concentração necessária de tal modo que 600 ± 100 partículas por tela são exibidas na exibição ao vivo. </li><li> Injectar a suspensão de alinhamento no instrumento NTA, tal como descrito na etapa 2.3. Pressione &quot;OK&quot; para iniciar o alinhamento automático, uma rotina automatizada através do qual o sistema irá automaticamente encontrar a posição ideal dos dois focos. </li><li> Quando aparece uma solicitação indicando o sistema está pronto para os experimentos, clique em OK para iniciar a medição. </li><li> Ocasionalmente, limpar o canal célula manualmente entre experiências lavando a célula com uma solução a 30% de etanol. Limpe o canal sempre que o software exibe um relatório de erros automática. </li></ol> 3. Medição da Amostra <ol><li> Lave o canal com água destilada antes do bismedição da amostra ch (como descrito no passo 2.3). </li><li> Injectar a suspensão exossoma (preparada na secção 1) para o canal, tal como descrito na etapa 2.3. </li><li> Ajuste os seguintes parâmetros principais do software, conforme necessário: <ol><li> Sensibilidade. A fim de encontrar a faixa de sensibilidade ideal, clique no botão &quot;número de partículas versus sensibilidade&quot; para exibir uma curva para partículas medidas por tela para diferentes níveis de sensibilidade. Escolheram um nível de sensibilidade antes do declive máximo da curva. Um nível de sensibilidade mais elevada permite a visualização de mais partículas pequenas, mas também aumenta as questões relacionadas com o ruído de fundo. </li><li> Brilho mínimo. Escolheu um brilho inicial de 20 para medição exosome para utilizar esta função como um filtro. Regule este parâmetro até em branco se fortemente partículas de dispersão da luz. Regule-o para baixo para amplificar fracamente espalhando artefatos. Varie o brilho conforme necessário durante todo o experimento. NOTA: As partículas que luz-Scatter muito fortemente se sobrepõem e podem ser excluídos da análise por engano. </li><li> Min e Max Size. Definir um filtro digital para eliminar o ruído de pixel e dispersão indesejada de partículas de grandes dimensões regulando o tamanho mínimo e máximo. Utilize uma gama de 10 a 500 pixels para a medição de exossomas. </li><li> Shutter. Ajustar o período de tempo em que a câmara é aberta para 1/300 seg. </li></ol></li><li> Viva parâmetros lidos: <ol><li> Alternar entre uma câmera digital e uma vista modus análogo a qualquer momento clicando no botão &quot;Viva-imagem&quot;. </li><li> Durante todo o experimento, monitorar a barra de intensidade de espalhamento, que apresenta o estado de saturação da amostra, tal como um indicador de cor codificada. Não analise exossomos se a barra de espalhamento é vermelho. Em tal caso, diluir a amostra para evitar este fenómeno. Se a condição experimental proíbe a manipulação da suspensão da amostra, para baixo-regular a sensibilidade ou up-regular o brilho no software-sCONFIGURAÇÃES ​​para melhorar os resultados da medição. NOTA: Quando se analisam as amostras com uma concentração extremamente elevada de partículas a dispersão se fundirão partículas individuais e eles são contadas como uma única partícula. </li><li> Observe que o número de partículas contadas no campo de visão do visor. </li></ol></li><li> Clique na aba &quot;Medição&quot;. </li><li> Escolha as configurações na matriz &quot;opções de execução&quot;. <ol><li> Antes de cada aquisição, selecione &quot;movimento de seleção &#39;para uma verificação repetida teste de partícula drift. Realizar o teste pelo menos uma vez antes de começar toda a análise. Se o desvio for maior do que 20 mm / seg, esperar antes de continuar a medição de modo a que a amostra pára de fluir. </li><li> Escolher o número de experiências (5) e o atraso de tempo entre eles (0). </li><li> Realize um &quot;cheque sample &#39;, se necessário. Este teste é parte do alinhamento automático no procedimento de inicialização e pode ser repetido mais tarde, conforme necessário. </li&gt; </ol></li><li> Por fim, clique no botão &quot;aquisição de vídeo executar&quot;. Na nova janela, definir o número de ciclos (15) e o número de posições de medição (11). NOTA: A cabeça de laser e o microscópio pode ser movido para analisar o número de partículas em 11 posições diferentes. Dependendo da procura experimental, decidir se a experiência deve ser realizada numa única posição ou em posições diferentes. <ol><li> Confirme o tempo de duração mínima de uma partícula tem que ser controlado para ser contada como uma partícula individual, definindo a resolução de vídeo (baixo). A diminuição dos resultados de resolução em um período mais curto de seguimento. </li><li> Escolha um nome de arquivo e clique em &quot;OK&quot; para iniciar a medição. </li></ol></li></ol> 4. Interpretação dos Resultados <ol><li> Ver os seguintes resultados e parâmetros exibidos após a medição na aba &quot;resultados&quot;: (1) o número total de partículas traçadas, (2) número médio de parteicles por posição, e (3) a concentração de partículas. <ol><li> Ver tabela média do resultado para a relação numérica de tamanho de partícula (diâmetro, superfície e volume) a percentagem do número de partículas, assim como os valores de média e diferenciação padrão. </li><li> Use a tabela de análise de pico se mais de um pico existe na análise gráfica. Esta tabela mostra a distribuição de partículas que são menores do que o primeiro ou respectivamente segundo pico. </li></ol></li><li> Veja o gráfico calculado após a medição para ver uma distribuição de partículas por tamanho. Use os ícones no modo de exibição e acima do gráfico para alterar as configurações. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

Nós demonstramos um protocolo detalhado para o isolamento de exossomas a partir do sangue e de seguimento de nanopartículas presentes como um método novo e inovador para medir o tamanho de exossoma e concentração num fluido biológico. Nas experiências apresentadas no sangue periférico humano foi utilizado como a origem dos exossomas. No entanto, outras origens, tais como urina, expectoração, o sobrenadante da cultura de células, etc, também podem ser utilizados como material de teste. Com base na variabilidade biológica de concentração de exossoma em seres humanos, os ensaios de diferentes indivíduos podem apresentar uma concentração variando notavelmente de exossomas. No entanto, a concentração de partículas na ponta de prova biológica pode ter um impacto sobre os resultados. Portanto, é necessária uma abordagem confiável e padronizada para a diluição de sondas. No método apresentado exossomas contendo plasma foi gerado a partir de 9 ml de sangue total periférico. Utilizando centrifugação diferencial, os passos de uma pelota foi isolado a partir de exossoma1 ml de plasma e re-suspensos em 5 ml de água destilada para provocar a amostra de trabalho de exossomas suspensos. Essa configuração pré-definida nos proporcionou uma concentração adequada de partículas, ou seja, a intensidade de dispersão adequada durante NTA. Ao lado do volume e diluição aspecto, a composição das soluções que são usadas também é de importância. Temos utilizado água destilada para a re-suspensão final de exossomos. Naturalmente, também podem ser utilizados diferentes meios de comunicação para o passo final de diluição, de acordo com os requisitos da instalação experimental. No entanto, no caso de medições de potencial zeta de soluções-iónicos, particularmente no caso dos ensaios de amostras com uma capacidade de tamponamento, uma diluição prudente em condições livres de turbulência é útil. Para a comparação direta de várias amostras recomendamos manter o mesmo nível de diluição para todas as amostras. Todas as configurações, exceto a sensibilidade e resolução de vídeo pode ser alterado mais tarde, utilizando o software Análise ZetaView. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Embora os autores acreditam que o sistema introduzido aqui representa atualmente o instrumento mais adequado, não é o único sistema disponível NTA. Uma série de relatórios anteriores empregaram outros sistemas que se aplicam os mesmos princípios NTA mas fornecem um outro projeto instrumento que vai junto com algumas características diferentes 10. Acreditamos que os aspectos práticos relativos à manipulação da amostra e reprodutibilidade dos resultados são de importância central na escolha da seqüência metodológica para avaliação exosome. Acreditamos também que um sistema de detecção ideal deve eliminar fatores dependendo do usuário que podem interferir com os resultados das medições. A análise abordagem exosome que é aqui apresentado cumpre o critério de fácil manuseio para um alto grau. Como uma vantagem adicional, a análise semi-automatizada de amostras é realizada em um processo rápido, a geração de resultados em um curto período de tempo. Uma visualização online de exossomos auxilia o analisador para gaem uma ideia imediata do exossoma características, por exemplo, a concentração bruta. Uma adição muito simples e elegante para a técnica de medição aqui apresentada é a utilização de anticorpos etiquetados e a captura de exossomas de o feixe de laser dispersa usando um filtro anterior em frente do detector. Desta forma, as subpopulações de exossoma podem ser diferenciados de acordo com seus antígenos de superfície e outras características biologicamente relevantes que são tecnicamente acessíveis a uma coloração fluorescente seletivo. Uma desvantagem das actuais versões do nosso instrumento de rastreamento de partículas é o facto de que em níveis muito elevados de sensibilidade artefactos, tais como o ruído de fundo pode tornar-se presente, que se baseia na parede do canal celular. A solução técnica e melhoria para o sistema atual pode se tornar disponível em um futuro próximo. Por este método reflexões da dispersão de luz laser sobre a parede do canal será reduzida, aumentando assim<html> a precisão dos sinais medidos e os dados obtidos e a redução do limite de detecção. Embora o protocolo usado atualmente para o isolamento exosome está bem estabelecida e o instrumento de rastreamento de partículas aplicada tem uma resolução extremamente precisa, com uma distribuição de tamanho menor de 30 nm, não há garantia de que as partículas detectadas são de fato inteiramente verdade exossomos. Outras partículas, tais como fragmentos de células mortas ou complexos proteicos maiores também podem estar presentes na suspensão exossoma e levar a sinais positivos falsos. Um método confiável pelo qual essa &quot;poluição&quot; pode ser excluído pode ser microscopia eletrônica (ME), quer EM transmissão ou EM digitalização. Infelizmente, nenhum marcador específico e geral para exossomos foi identificado até o momento, embora um número de marcadores de superfície anteriormente propostos ganharam uma quantidade crescente de atenção, incluindo tetraspanina (tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11. &quot;&gt; Independentemente do futuro progresso da investigação em biologia exosoma, nomeadamente no que respeita a marcadores específicos de exossoma, o protocolo que é aqui apresentado proporcionará um método poderoso para o isolamento e detecção de exossomas. A concentração e tamanho pode ser facilmente determinada num assistido software forma simples. A adição de marcadores fluorescentes seletivos ou anticorpos fluoróforo acoplado provavelmente irá aumentar ainda mais as possíveis aplicações da abordagem apresentada de NTA.

A função exata de exossomos circulam permaneceu desconhecido por um longo período de tempo. Mesmo se agora o mecanismo de caminho completo de exossomas não é totalmente compreendido. Desde exossomas transportar antigénios, proteínas e ARN (ARNm e miARN) que lhes diz respeito a sua célula de origem parental, a sua função como transmissores de sinalização célula-célula, principalmente, foi dada prioridade. Muitos métodos diferentes têm sido descritas na literatura para o isolamento e detecção quantitativa de exossomas 1,2. No entanto, não há consenso sobre um &quot;padrão ouro&quot; foi atingido. Enquanto isso, a maioria dos cientistas que operam no domínio da investigação exosome concordam que um método consistente de isolamento é altamente garantido para alcançar um maior grau de comparabilidade entre os diferentes relatórios e estudos. Fluorescência ativado separação de células (FACS) é a ferramenta mais comum e prevalente para análise exosome 3. FACS tem o benciar que, através de marcação por fluorescência, as células de diferentes origens pode ser comparado, em um passo. As principais desvantagens da FACS são de que este método não é sensível o suficiente para identificar as partículas menores que 0,5 mm 4, enquanto que exossomos são geralmente entre 30-120 nm de diâmetro 5, ainda menos para medir o seu tamanho. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) são outras ferramentas para a análise do tamanho das partículas e morfologia de exossomos. No entanto, tanto SEM e TEM tem a desvantagem de que a preparação de amostras é, ambos os métodos envolvem passos de trabalho intensivo, consumidores de tempo e cada um tem um certo risco de geração artefato. Nenhum método é apropriado para elevado débito de amostras e caracterização de vários milhares de partículas individuais de uma amostra. Além disso, uma análise quantitativa para a rotina clínica diária, onde as amostras têm muitas vezes de ser analisadas simultaneamente, ou pelo menos em um período muito curto édifícil de executar. Novas técnicas de geração de agora nos permitem analisar exosomes sem intenso trabalho preparatório antes (SEM por exemplo, ambiental). Estas técnicas modernas ainda são bastante inconveniente para análise de grandes volumes contendo suspensões exosomes para determinar o seu número médio e distribuição de tamanho 6. Outro método altamente sensível para a visualização e análise de exossomos é de rastreamento de nanopartículas análise (NTA). Este método leva vantagem de dois princípios diferentes da física. Em primeiro lugar, as partículas são detectados pela luz dispersa quando são irradiados com um feixe de laser. O segundo fenómeno é conhecido como movimento Browniano, segundo a qual a difusão de partículas diferentes em uma suspensão líquida é inversamente proporcional ao seu tamanho. Neste último caso, o movimento também depende da temperatura e da viscosidade do líquido. No entanto, esta taxa está diretamente relacionada ao tamanho das partículas e é usado por NTA. Usando suaveanálise baseada-ware, imagens digitais de luz difusa de partículas individuais são gravadas. A parcela de manchas de luz difusa e a sua velocidade de movimento fornecer os dados que facilitar a determinação da contagem total de partículas e distribuição de tamanho. Esta técnica é particularmente poderosa para a análise de partículas com um diâmetro médio de menos de 100 nm. As medidas de tamanho e concentração são realizadas com o ZetaView browniano e Microscópio Análise Eletroforese de vídeo de animação. Este é um desk top nanopartícula instrumento de análise semi-automatizado para amostras líquidas (doravante referida como o instrumento de rastreamento de partículas). Consiste no analisador de partículas de rastreamento, bem como um computador portátil com o software utilizado para a análise de dados. Amostras biológicas heterogéneos são tão adequados para este método como suspensões mais homogéneos de partículas inorgânicas. Um microscópio de dispersão a laser com uma câmara de vídeo é usado para a detecção de partículas e para a OBSErvação de seu movimento. Enquanto o eixo horizontal e microscópio é focada dentro do canal celular preenchido com uma suspensão contendo exossomas, o feixe de laser é orientado verticalmente. As partículas irradiadas pela dispersão de laser a luz, que é contabilizada em 90 ° por uma câmera de vídeo digital através do microscópio (Figura 1). A intensidade da luz dispersa permite a observação de partículas superiores a 60 nm de diâmetro. Numa tal configuração do brilho de uma partícula não é a única indicação de tamanho de partícula. Quando nenhum campo elétrico é aplicado, o movimento de partículas só segue o movimento browniano e pode servir como um indicador para o cálculo do tamanho das partículas. No entanto, o instrumento também é capaz de aplicar um campo eléctrico através do canal celular. Quando submetido a este campo, o potencial, polaridade e nível de carga iônicos dos exossomos suspensas se tornarem outros determinantes da direção de seu movimento. Velocidade e direção resultado em um mo eletroforéticahistograma dade. Enquanto encontrar um método ideal para analisar exossomas isoladas é um problema, um outro está no isolamento eficaz de exossomas a partir de diferentes meios, tais como sangue, ascites, urina, leite, fluido amniótico ou meio celular. Diferentes métodos têm sido descrita até agora, que são baseados em ultracentrifugação 1, reagentes de separação industriais (como Exoquick 7), esferas magnéticas para antigénio empregando separação 8 ou 9 passos de ultrafiltração. Neste protocolo, demonstrar todo o processo de isolamento exosome via ultracentrifugação e mostrar como analisar a exosome resultante contendo suspensão através de um instrumento de rastreamento de partículas. As considerações específicas para a análise de médias no plasma ou cultura de células humanas exossomas derivados são fornecidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

As amostras utilizadas para esta demonstração mostra uma configuração óptima para a medição com uma sensibilidade de 85%, antes do declive máximo da curva de sensibilidade (Figura 2). O brilho, o min / max valores foram escolhidos como recomendado no protocolo. Uma concentração de 5,3 partículas / ml x 10 6 foi medido, enquanto que o tamanho médio das partículas foi de 0,149 um, a maioria deles eram de 0,137 mm. Os valores recebidos após a medição podem ser salvos em um relatório com um formato de arquivo .pdf ou como .txt para exportar em um banco de dados. O gráfico pode ser ajustado como preferidos, tal como descrito no protocolo (secção 4). A sequência de vídeo é guardado e também pode ser utilizado mais tarde para fora da linha de re-análise. No entanto, em tal análise off-line, as configurações pré-aquisição da câmara não podem ser alterados de forma retrospectiva. A fim de encontrar as configurações dos parâmetros ideais para a medição, nós aqui descrever the otimização das configurações do instrumento sobre o exemplo de um 100 nm tamanho padrão de poliestireno. A influência de dois parâmetros, sensibilidade e min / tamanho máximo em distribuição de imagens de vídeo e tamanho de partícula é discutido em detalhe. Todos os outros parâmetros são resumidos na Tabela 1. A impressão visual do impacto de sensibilidade (variando de 50 a 94) em imagens analógicas e digitais é visualizado na Figura 3. A informação quantitativa derivada a partir das imagens é apresentado na Figura 4, com base nas configurações da Tabela 1, Min = Tamanho 5 e Tamanho máximo = 200. Uma relação típica de o número das partículas detectadas vs. sensibilidade é mostrado na Figura 4A. Entre 50 e 90, o número de partículas detectadas com sensibilidade aumentada e aumentou dramaticamente para sensibilidades&gt; 90. Encontrou-se uma faixa ideal de sensibilidade entre 66 e 86 (A). Distribuições de tamanho de partícula obtida com difajustes de sensibilidade rentes são apresentados na Figura 4B. As distribuições de tamanho de partícula representam a média de três medições individuais. Por muito baixa sensibilidade (sensibilidade = 62, curva vermelha) só foram analisadas algumas partículas resultando em estatísticas bastante pobres. O número de partículas com sensibilidade analisados ​​aumentou e alcançou um valor óptimo entre 70 (curva de amarelo) e 86 (curva tan). Aumentando ainda mais o chumbo sensibilidade a uma deterioração da distribuição de tamanho de partículas, com o número de partículas que deixam cair e distribuição de tamanho mudando para tamanhos menores (sensibilidade = 94, curva azul). A figura 4C mostra a tendência de o diâmetro x50 baseada no número (50% de partículas são menores do que este diâmetro) como uma função de sensibilidade. No intervalo bege, o RSD de tamanho de partícula foi inferior a 8% e corresponde ao intervalo óptimo em A. As regiões vermelhas indicam RSD&gt; 8%, como resultado de estatísticas pobres (sensibilidade muito baixa) ou ampla distribuições com mudança para tamanhos menores (sensibilidade muito alta). As configurações do Min Size e Max Size são os filtros aplicados a imagens digitais, a fim de remover as partículas com tamanhos de ponto inferior a Min Tamanho e maiores do que Max Size. Devido à capacidade de dispersão de luz, uma partícula cria um local de um determinado tamanho de uma imagem digital. O tamanho da mancha é medido como um número de pixels (px). Quando uma partícula dispersa a luz muito bem (por exemplo, partículas de&gt; 200 nm ou agregados), o tamanho do local é bastante grande, por exemplo,&gt; 500 px. O tamanho do ponto é muito pequena (por exemplo, &lt;10 px) de pequenas partículas (por exemplo, &lt;20 nm), dependendo do material de partículas. Tamanho de ponto (px) não podem ser trocadas com tamanho de partícula (nm), como eles não são idênticos e não existe uma relação direta entre essas duas variáveis. Uma otimização de Min e Max Tamanho permite ao usuário filtrar os objetos indesejados tais como aglomerados (Max Tamanho) ou pequenaobjetos, como ruído de fundo (Min tamanho). A influência de Min / Max tamanho da distribuição do tamanho das partículas de um tamanho padrão de 100 nm é mostrado na Figura 4D (sensibilidade = 82). Quando o intervalo é definido como pequenos tamanhos de ponto (por exemplo, min = 1, max = 52; curva de laranja), o número de partículas é reduzido e analisados ​​o diâmetro x50 baseado número é ligeiramente deslocado para tamanhos menores. A definição para manchas maiores (min = 40, max = 1.000; curva vermelha) resulta em uma ampla distribuição de tamanho de partículas deslocado para tamanhos maiores. A fim de se obter o número total de partículas iguais, os limites do intervalo de distribuições tanto laranja e vermelho foram ajustados para coincidir com 80 partículas. A distribuição com configurações mais eficientes (min = 5, max = 200; tan curva) consiste em 360 partículas. Uma série de experiências foram realizadas com sucesso exossomas isoladas por ultracentrifugação e medidos por NTA utilizando o sistema apresentado. Os dados resultantes eram altamenteconsistente e confirmou um nível elevado de reprodutibilidade. Outros métodos de isolamento deve mostram resultados semelhantes. No entanto, o passo de diluição foi identificado como um passo particularmente crítico e o seu impacto sobre os números totais calculados de partículas tem de voltar a ser avaliadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema da instalação do NTA. A / eixo vídeo microscópio e feixe de laser são orientadas perpendicularmente um ao outro, cruzando a seção transversal do canal celular. Luz espalhada pelas partículas é exibido no &quot;live-view&quot; janela do software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Número de partículas versus curva de sensibilidade. O número de partículas versus curva de sensibilidade mostra as partículas em uma posição em um momento durante uma verificação de sensibilidade automático. Esta visualização gráfica é usada para determinar as preferências para as melhores medições iniciais. Um valor de sensibilidade é escolhida antes do declive máximo do gráfico. É importante lembrar que os artefatos não são eliminadas neste experimento de teste e pode afetar o gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> Figura 3. Impacto da sensibilidade em analógico e digital de imagens. A visualização de partículas na tela de visualização ao vivo é exibido para sensibilidades entre 50 e 94, tanto para analógico (linha superior) umd digitais vistas (linha inferior). Quando a sensibilidade é muito baixo, apenas umas poucas partículas são detectados (esquerda). Em ótima sensibilidade as partículas aparecem como pontos de solteiro bem isolados uns dos outros (no meio). Em um comparativamente altas partículas sensibilidade fundem levando a má qualidade de imagem (à direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> Figura 4. Influência da sensibilidade min e as configurações de tamanho máximo para uma amostra de controlo de 100 nm de poliestireno de partículas (A) Lote de sensibilidade versus o número detectado de partículas.; o intervalo óptimo é 66-86, antes do declive máximo da curva. Distribuições (B) de tamanho de partícula obtido com várias configurações de sensibilidade (62-94); gráficos para muito baixo (62) ou muito alta (94) de sensibilidade não captam a distribuição de tamanho de partícula de 100 nm para a amostra de controlo de poliestireno. (C) Número baseado diâmetro x50 contra sensibilidade; o erro de 50x no intervalo bege é inferior a 8%, intervalo ideal é de 66 a 86. (D) Impacto de Min e Max tamanho da distribuição do tamanho de partícula; parâmetros ótimos (min = 5 e max = 200) capturar a distribuição correta para a amostra de controlo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Parâmetros pré-aquisição </td></tr><tr><td> Sensibilidade </td><td> variável </td></tr><tr><td> Persiana </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Taxa de quadros </td><td> 30 fps </td></tr><tr><td> Resolução </td><td> Oigh </td></tr><tr><td> Cycles </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Várias Aquisições </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Posição </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> Parâmetros pós-aquisição </td></tr><tr><td> Min Brilho </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Max Size </td><td> variável </td></tr><tr><td> Min Tamanho </td><td> variável </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Resumo dos parâmetros pré e pós-aquisição para definição do instrumento de rastreamento de partículas.

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An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Um método inovador para exossomo Quantificação e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K visualizações.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biologia

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Ultrafiltração de fluxo tangencial: um método &quot;verde&quot; para a seleção do tamanho e concentração de nanopartículas de prata coloidal

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Estabelecimento de um pH extracelular ácido sistema de cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...