Os resultados da NTA são muito propensos ao viés do operador. Este protocolo demonstra os efeitos dos parâmetros alterados da NTA sobre os resultados obtidos. Um método padronizado ajudará a aumentar o rigor e a reprodutibilidade na análise da NTA.
Analisar a amostra em um cuvette permite que uma amostra estatisticamente aleatória seja capturada em cada vídeo. Isso resulta em dados mais reprodutíveis e na visualização de partículas sobre uma ampla gama de tamanhos. Como obter uma amostra na faixa de concentração de partículas recomendada pode ser difícil, certifique-se de realizar uma diluição serial para identificar o fator de diluição ideal.
Demonstrando o procedimento estará Kungheng Cai, um estudante de doutorado do laboratório de Anthony Ferrante. Para preparar a cuvette para análise de rastreamento de nanopartículas, cubra o espaço de trabalho com um material livre de fiapos para evitar que as fibras entrem nas cuvetas. Usando luvas, coloque uma cuvette contendo uma barra de agitação no gabarito magnético cuvette.
Use uma ferramenta de gancho para colocar a inserção na cuvette com o entalhe da inserção visível na frente da cuvette. Use uma pipeta para adicionar lentamente 400 a 500 microliters de vesículas extracelulares purificadas no cuvette através do orifício na inserção e misture a amostra gentilmente tubos sem introduzir bolhas de ar, em seguida, tampar o cuvette, batendo bolhas conforme necessário e usar um pano sem fiapos para limpar a superfície externa da cuvette. Para analisar a concentração de partículas do diluído ou de uma amostra, ligue a estação de trabalho e o instrumento do computador e inicie o programa de análise de rastreamento de partículas.
Quando solicitado, clique em NTA e abra a guia de gravação. Siga as instruções na tela para preencher todas as informações necessárias para a amostra. Para análise de rastreamento de EV, defina o diluído para PBS.
A salinidade irá autopovoar para 9% Para obter a concentração de partículas diluída ou amostra, abra a tampa do instrumento e remova a tampa protetora que cobre onde o cuvette será colocado. Carregue o cuvette no instrumento na orientação correta com o entalhe da inserção voltada para a câmera e substitua a tampa e a tampa do instrumento. Clique na seta de streaming para ligar a câmera e clique na seta chevron para expandir as configurações de gravação.
Ajuste o foco até que as partículas relativamente pequenas sejam claramente visíveis. Para definir a análise para uma pequena quantificação de EV, defina a taxa de quadros para 30 quadros por segundo, a exposição a 15 milissegundos, o tempo de agitação para cinco segundos, o tempo de espera para três segundos, os poderes de laser azul, verde e vermelho para 210, 12 e 8 miliwatts, respectivamente, os quadros por vídeo para 300, e o ganho para 30 decibéis. Ajuste o foco até que as partículas relativamente pequenas sejam claramente visíveis.
Aumentar o zoom e/ou o ganho pode ajudar no foco de partículas. Mas se você aumentar o ganho, lembre-se de defini-lo para 30 decibéis antes de gravar. Uma vez que as partículas estejam em foco, defina a configuração de zoom para 0,5X para salvar a largura de banda e para evitar quadros de perda e clique em gravar para começar a gravar o vídeo.
Quando um prompt aparecer informando que os vídeos foram gravados, clique em OK para concluir a gravação e selecione a guia do processo. Se partículas muito grandes eram visíveis em qualquer vídeo durante a gravação, navegue até o diretório de vídeos gravados e remova qualquer vídeo problemático antes do processamento. Verifique a caixa de detecção de áudio desativada e defina o diâmetro do recurso para 30.
Clique no processo para iniciar o processamento de vídeo e visualize um gráfico de distribuição ao vivo. Quando o processamento estiver concluído, clique em OK e selecione a guia plot. Para EVs, exiba o gráfico principal como silica de caixa de registro.
Outras características do gráfico, como a alteração do eixo x para definir a área de integração da figura produzida, podem ser personalizadas. Para criar um relatório PDF dos resultados, clique no botão relatório. A média, mediana, o tamanho do modo e a concentração ajustadas para o fator de diluição e largura de distribuição serão exibidos.
A NTA do diluente deve ser realizada antes de qualquer amostra para que a concentração deste em branco possa ser subtraída da concentração de partículas da amostra de EV. Para limpar as cuvetas após a análise, esvazie a cuvette e encha completamente as cuvetas de 10 a 15 vezes com água desionizada e as três vezes com 70 a 100% de etanol para remover qualquer amostra residual. Seque o lado de fora das cuvetas com um pano de microfibra sem fiapos e seque o interior com um espanador de ar comprimido.
Para limpar as pastilhas e mexer as barras, coloque os materiais em um frasco de cintilação de vidro contendo 70 a 100% de etanol e agite o frasco vigorosamente. Em seguida, enxágue as pastilhas e mexa em barras em água desionizada com agitação como demonstrado e seque-as usando panos sem fiapos. Após a secagem, coloque imediatamente todos os componentes limpos no armazenamento até a próxima análise.
Antes de realizar uma análise, a calibração do instrumento foi testada utilizando contas de poliestireno para garantir a validade dos dados adquiridos. Como observado, o instrumento de rastreamento de partículas relatou com precisão o tamanho das contas de manodisperse de 100 nanômetros, mas apenas relatou de perto o tamanho das contas de 400 nanômetros. Portanto, as configurações de instrumentos para este protocolo foram mais precisas para partículas menores, perto de 100 nanômetros de tamanho.
Utilizando essas configurações, as escalas de concentração de partículas relatadas de acordo com o fator de diluição demonstram que o instrumento pode detectar com precisão a concentração de partículas em várias diluições com pouca variabilidade entre replicantes técnicos. A diluição ideal para uma amostra de EV derivada de tecido de camundongos 4,41 vezes 10 para a décima por mililitro de tecido derivado do tecido foi determinada entre 1.000 e 3.000. Nesta análise, o aumento do ganho aumentou a sensibilidade da câmera, permitindo um aumento na visualização de um maior número de partículas menores.
O aumento da potência do laser azul de 70 para 210 miliwatts, mantendo os poderes laser verde e vermelho constantemente, mudou o tamanho médio de partículas relatado de 122 para 105 nanômetros e aumentou a concentração total de partículas relatada de 1,1 vezes 10 para o oitavo para 1,7 vezes 10 para o oitavo. O aumento da potência do laser vermelho aumentou o tamanho médio de partículas relatado de 175 para 246 nanômetros e diminuiu a concentração total de partículas relatada. O aumento da potência do laser verde resultou em uma diminuição no tamanho médio de partículas relatada e um aumento na concentração total de partículas relatada.
Encontrar a diluição certa para colocar uma amostra dentro do intervalo ideal de detecção pode levar algumas tentativas para cada amostra. A limpeza de cuvette também requer um manuseio extra cuidadoso. Recomendamos a aplicação de mais de um método ortogonal para medidas de tamanho de partículas e concentração de EV.
Dispersão dinâmica de luz, sensoriamento de pulso resistivo, microscopia eletrônica de transmissão e sensor de imagem de refletia interferométrica de partículas únicas também podem ser realizadas para caracterizar EVs.
