Este estudo foi apoiado pela Fundação Lundbeck, a Fundação NOVO-Nordisk, o Conselho dinamarquês de pesquisa independente | Ciências médicas, e da Fundação NORDEA Grant para o centro de envelhecimento saudável.

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Nacional de ética dinamarquês de acordo com as diretrizes estabelecidas na Convenção do Conselho Europeu para a proteção de animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros propósitos científicos e conformidade com as orientações de chegada. Este é um procedimento terminal com os ratos que estão sendo eutanasiados antes da recuperação anestésica.
1. preparação pré-cirúrgica
<ol><li>Limpe a mesa cirúrgica e toda a área circundante com 70% de etanol. Limpe e seque cuidadosamente as ferramentas cirúrgicas antes da cirurgia.</li>
	<li>Anestesiar um mouse NG2DsRed (TG (Cspg4-DsRed. T1) 1Akik/J; ambos os sexos; 4-8 meses de idade) por uma injeção peritoneal de cetamina + xilazina (60 mg/kg + 10 mg/kg) dissolvido em água esterilizada, pH 7,4. Administrar doses suplementares de cetamina (30 mg/kg) a cada 25 min até a conclusão do procedimento cirúrgico. Verifique os reflexos da cauda e do dedo pitada regularmente para verificar a profundidade da anestesia.</li>
	<li>Injete a solução salina subcutaneamente em quatro locais diferentes na parte de trás do mouse para um volume total de 1 mL para evitar a desidratação durante o experimento. Para proteger os olhos de secar, aplique o lubrificante do olho. Mantenha a temperatura corporal a 37 ° c usando uma sonda de temperatura retal e cobertor de aquecimento.</li>
</ol>2. procedimento cirúrgico
<ol><li>Traqueotomia
	<ol>
<li>Coloque o rato nas costas. Injete 0, 4 mL de lidocaína a 0,5% por via subcutânea a incisão planejada e aguarde 2 min. faça uma incisão de 10 mm de comprimento acima do osso do tórax (manúbrio). Separe as glândulas submandibulares e os músculos esternotireoidianos e, em seguida, exponha a traquéia.</li>
		<li>Faça o traqueostomia entre dois anéis tracheal com tesouras. Insira um tubo metálico pequeno com um comprimento de 16,2 mm e um diâmetro de 1 mm na traquéia. Conecte o tubo a um ventilador mecânico e a um capnógrafo para monitorar o CO2 expiratório final (Figura 1a).</li>
	</ol></li>
	<li>Inserção do cateter
	<ol>
<li>Injetar 0,5% de lidocaína (0, 4 mL) por via subcutânea a incisão planejada e aguardar 2 min.</li>
		<li>Usando o fórceps fino da ponta separe delicadamente a artéria da veia. Pare o fluxo sanguíneo a montante com um grampo microvascular. Constrict o fluxo sanguíneo a jusante com uma sutura de nylon 10-0 ligando ambos os vasos sanguíneos.</li>
		<li>Use tesouras de microdissecação para fazer uma pequena incisão na artéria e na veia. Insira cateteres plásticos em ambos os vasos sanguíneos. Fixe os cateteres apertando as suturas (8-0 ou 10-0 suturas de náilon dependentes do tamanho do vaso) sem comprometer os lúmens do cateter. Retire a braçadeira microvascular e feche a pele.</li>
		<li>Monitore a pressão sanguínea através do cateter arterial. Medir os níveis de gases sanguíneos em amostras de sangue arterial (50 μL) antes e depois de cada experimento (valores normais: pO2, 90-120 mmHg; PCO2, 35-40 mmHg; pH, 7.45) usando um analisador de gás sanguíneo. Utilize o cateter venoso para perfusão de fluoresceina e anestesia.</li>
	</ol></li>
	<li>Craniotomia
	<ol>
<li>Raspar a pele da cabeça do mouse entre as orelhas. Injete 0, 4 mL de lidocaína a 0,5% por via subcutânea a incisão planejada e aguarde 2 min.</li>
		<li>Limpe o crânio usando uma solução de cloreto de ferro a 10% para remover o periósteo. Enxague cuidadosamente o crânio com soro fisiológico. Cole uma barra de metal na cabeça do crânio com cola de cianoacrilato e ativador (Figura 1a). Nota: a barra da cabeça de metal tem 75 mm de comprimento e 13,5 mm de largura, com um furo redondo de 5 mm de diâmetro no centro.</li>
		<li>Perfure uma craniotomia de 4 mm de diâmetro, centrada em 0,5 mm atrás e 3 mm à direita da Bregma sobre o córtex do tambor sensorial direito. Retire a dura-máter com um dilatador de vasos de ponta fina.</li>
		<li>Cubra o córtex exposto com gel de agarose 0,75%, dissolvido em líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF; pH = 7,4) e resfriado a 35 ° c. Cubra 80-90% da craniotomia com um lamínula de vidro em um ângulo de 10-15 ° à barra principal do metal (Figura 1B) que permite a inserção e a colocação da micro-pipeta de vidro.</li>
		<li>Para minimizar a pulsação do cérebro, Cole os dois cantos do lamela de vidro na barra principal do metal com colagem e activador do cianoacrilato. Aplique o ativador com cuidado para evitar entrar no cérebro exposto. Enxague cuidadosamente a lamínula de vidro colada com soro fisiológico.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a inserção da sonda de estimulação da almofada do Whisker. Insira um conjunto de eletrodos bipolares feitos medida (8 mm de comprimento e 0,25 mm de espessura) percutaneamente no lado esquerdo da face para estimular o ramus infraorbitalis do nervo trigeminal contralateral à craniotomia. Posicione o cátodos perto do hiato infraorbitalis e insira o ânodo nos músculos mastigatórios7. Realize a estimulação com um estimulador elétrico a uma intensidade de 1,5 mA para 1 ms em trens de 20 s a 2 Hz.</li>
	<li>Após a conclusão da cirurgia, administrar um bolus de 0, 5 ml fluoresceína isothiocyanate-Dextran (FITC-Dextran, 4% w/v, peso molecular [MW] 50.000) na veia femoral para rotular o plasma sanguíneo. Interrompa a cetamina e mude a anestesia para infusão intravenosa contínua de α-cloralose (17% p/v, concentração final) misturada com FITC-Dextran (2% p/v, concentração final) em 0, 2 mL/10 g/h. Aguarde cerca de meia hora para a estabilização do novo Estado anestésico. Nota: o FITC-Dextran e o α-chloralose são dissolvidos em 0,9% de soro fisiológico.</li>
</ol>3. primeira sessão de imagens de dois fótons
<ol><li>Transfira o mouse para o estágio de um microscópio comercial de dois fótons (tabela de materiais). a proteína fluorescente vermelha (RFP, Figura 1c) e a proteína fluorescente verde (GFP, Figura 1c) modalidades da iluminação EPI-fluorescente, tomam um retrato do córtice exposto com um objetivo 5x. Use a imagem RFP como um ' mapa ' para a inserção da micropipeta de vidro na próxima sessão. Nota: o GFP ' map ' é usado para distinguir veias/venules de artérias/arteríolas.</li>
	<li>Execute a imagem latente do dois-fotão usando o microscópio do dois-fóton e um objetivo da água-imersão da abertura numérica de 25x 1,0 (NA) com motor piezo. Ajuste o comprimento de onda da excitação a 900 nanômetro. Procure o córtex e siga cada arteriol penetrante e encontre seus ramos horizontais (1St capillaries ordem).</li>
	<li>As arteríolas penetrantes da imagem e seus 1St capilares da ordem no descanso e durante a estimulação da almofada do Whisker. Consulte os parâmetros detalhados de imagem na seção 5.</li>
	<li>Marcar locais de 1St de capilares de ordem com > 5% de vasodilatação durante a estimulação da almofada do Whisker no ' mapa ' da RFP (Figura 1C). Locais com < 5% de vasodilatação são considerados como estando fora da região do córtex do barril de Whisker. Nota: se utilizar ratos de tipo selvagem em vez de ratos NG2DsRed no experimento, a imagem GFP é utilizada como ' mapa ' em vez disso.</li>
</ol>4. inserção da micropipeta de vidro
<ol><li>Prepare Micropipetas de vidro para soprar usando um extrator de pipeta (tabela de materiais). As micro-pipetas de vidro têm uma resistência de 3-3,5 MΩ e um comprimento do atarraxamento de 4.5-5 milímetros. Carregue uma pipeta com uma mistura de 1 mM ATP e 10 μM Alexa 594 para visualizar a ponta da pipeta a lâmpada EPI-fluorescente e o microscópio de dois fótons.</li>
	<li>Monte a micro pipeta de vidro em um suporte da braçadeira de remendo e conecte-a a uma bomba de ar. Ajuste a pressão de retenção da bomba para 0 psi.</li>
	<li>Usando a iluminação EPI-fluorescente vermelha, focalize na ponta da pipeta com o objetivo 5x. Coloque a micropipeta de vidro no aCSF acima do agarose. Ajuste a pressão de retenção da bomba de ar para 0,2 psi. Uma nuvem vermelha pequena pode ser observada ejting fora da ponta da pipeta no aCSF. Isto é para evitar entupimento durante a inserção da pipeta.</li>
	<li>Escolha um dos locais marcados no RFP ' map ' como destino. Mova a ponta da pipeta para o plano horizontal da borda de vidro da tampa com uma distância de 30 μm, apontando aproximadamente para o destino no plano x-y.</li>
	<li>Abaixe com cuidado a ponta da pipeta no eixo z o deslizamento de vidro da tampa. Em seguida, começar a avançar a pipeta de vidro em direção ao destino até ~ 500 μm acima da superfície do cérebro. Mude o foco freqüentemente entre a borda de vidro da tampa, a ponta da pipeta e a superfície do cérebro, certificando-se que há bastante espaço livre para mover a pipeta.</li>
	<li>Mude o objetivo para 25x. Recentro a ponta da pipeta e avance a ponta da pipeta mais para o destino no ' mapa ' do RFP. Mantenha a ponta da pipeta na camada de agarose.</li>
	<li>Quando a ponta da pipeta é ~ 100 μm acima da superfície do cérebro, mude o modo de imagem para microscopia de dois fótons. Concentre-se em um local de destino no qual soprar. Anote suas coordenadas x, y (x0, y0) e sua profundidade abaixo da superfície (z0). Calcule as coordenadas do ponto de inserção na superfície do cérebro (xi, yi) da seguinte forma: xi = x0 + z0 /Tan θ yi = y0 onde θ é o ângulo entre o suporte da pipeta e o plano horizontal.</li>
	<li>Posicione a ponta da pipeta nas coordenadas (xi, yi) na superfície do cérebro. Introduza suavemente e lentamente a pipeta até atingir (x0, y0, z0). Se um navio está no caminho de um caminho de inserção, retire a pipeta e recalcule outras coordenadas de inserção e caminho; ou gire ligeiramente a placa de estágio (conforme indicado na Figura 1a).</li>
	<li>Ajuste a pressão de retenção da bomba a 0 psi e a pressão de ejeção em 10-15 psi. Puff ATP para 200-400 MS no local de destino durante a imagem de dois fótons. Ajuste a pressão e a duração do sopro para cada pipeta e ao longo do tempo conforme explicado na seção de discussão.</li>
</ol>5. hyperstack imagem de dois fótons
<ol><li>Realize experimentos usando o microscópio de dois fótons e um objetivo de imersão em água de 25 x 1,0 NA com motor piezo. Ajuste o comprimento de onda da excitação a 900 nanômetro. Filtre a luz emitida para coletar a luz vermelha de DsRed (pericytes)/tetrametilrodamina isotiocianato-Dextran (TRITC-Dextran) manchando o plasma sanguíneo e a luz verde de FITC-Dextran (plasma sanguíneo)/GCaMP6 (GFP, cálcio astrocítico).</li>
	<li>Produza uma pilha z de alta resolução no local de interesse que contenha uma arteriol penetrante, um capilar de ordem 1St , um capilar de ordem de 2ND e possivelmente células fluorescentes vizinhas (por exemplo, pericytes, astrócitos). Determine o volume de x * y * z da imagem latente do hyperstack incluindo a estrutura 3D dos vasos sanguíneos tanto quanto possível. A altura total de cada pilha pode variar de 30-50 μm, enquanto o plano x-y cobre aproximadamente uma área de 60 μm x 40 μm.</li>
	<li>Defina a pilha de imagens no software de imagem a ser composta por 8-10 aviões com uma distância interplane de 4-5 μm. O objetivo piezo-motor pára em cada nível do eixo z para adquirir a imagem de cada plano. A taxa de amostragem é 1 s por pilha e a definição do pixel no plano x-y é 0.2-0.3 μm (Figura 2A). Uma gravação normalmente inclui 10 pilhas de imagens pré-sopro e 150 pilhas de imagens pós-sopro.</li>
</ol>6. processamento de dados
<ol><li>Processe dados usando software analítico feito medida. Aplainar cada pilha de imagens em uma imagem por projeção de intensidade máxima (Figura 2B). Desenhe uma região retangular de interesse (ROI) com uma largura de 3 μm perpendicularmente em toda a embarcação de interesse (Figura 2C).</li>
	<li>Para minimizar a interferência de sombras de glóbulos vermelhos e de pequenas vibrações do córtex, a média do ROI retangular, projetando-o em uma linha, que então representa o perfil médio do segmento da embarcação. Faça isso para cada imagem de intensidade máxima.</li>
	<li>Plotar as linhas de perfil como uma imagem 2D com o eixo x representando imagens de intensidade máxima em ordem cronológica (Figura 2D, painel superior). Use um algoritmo de contorno ativo (segmentação Chan-VESE) para encontrar as bordas da embarcação8,9 (indicada por curvas vermelhas; Figura 2 D, painel superior).</li>
	<li>Calcule o curso do tempo das mudanças de diâmetro como a diferença entre as bordas do vaso sanguíneo (distância vertical entre as curvas vermelhas superiores e inferiores na Figura 2D, painel inferior). Normalize as alterações de diâmetro para pré-soprar o diâmetro basal e traçar curvas de diâmetro mudam ao longo do tempo. Faça isso para cada ROI (Figura 2E).</li>
	<li>A amplitude de resposta do vaso é definida como a maior/menor amplitude de pico após o sopro. A latência de resposta é definida como a latência da amplitude Half-Max (Figura 2G). Trace manualmente a estrutura vascular esqueletizado colocando nós ao longo dos vasos (Figura 2F) e medindo a distância geográfica entre cada ROI e a arteriol penetrante. Calcule a velocidade de CVR dividindo as distâncias por diferenças de latência.</li>
</ol>7. injeção viral do vetor
<ol><li>A fim de estudar simultaneamente as respostas astrocíticas de cálcio, injetar um volume de 0,6 μL de vetor viral (pZac 2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) no córtex somatossensorial de camundongos NG2DsRed, seguindo o procedimento padrão de injeção de vetor viral estereotáxica a 10.</li>
	<li>Após três semanas, os astrócitos no córtex somatosensorial do camundongo expressam o indicador de cálcio geneticamente codificado, GCaMP6f. Siga o procedimento cirúrgico acima mencionado e a imagem latente do dois-fotão para ratos. Para distinguir entre astrócitos e vasos Lumina, TRITC-Dextran em vez de FITC-Dextran é usado para manchar o vaso vermelho Lumina.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease.">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses.">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks.">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo.">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo.">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex.">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li><li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation.">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li><li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images.">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain.">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain.">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).</li><li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2++Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo.">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li><li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons.">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726 (2018).</li><li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+(Scape)+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms.">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um dos desafios para os estudos vasculares é a mensuração precisa dos diâmetros dos vasos. O método que nós descrevemos aqui usou um objetivo piezo motorizado para fazer a imagem latente rápida e repetitiva do hyperstack pela microscopia do dois-fotão. Firstly, este método permite examinações repetidas da arteriole penetrante, da ordem 1 doSt e dos capilares da ordem 2ND sem perda de foco e conduziu à descoberta de respostas vasculares lentamente conduzidas nos capilares in vivo. Em segu...

O cérebro tem uma alta taxa de consumo de energia. Cerca de 20% do oxigênio e 25% da glicose consumida pelo corpo humano são dedicados à função cerebral, enquanto o cérebro só ocupa 2% da massa corporal total. A manutenção da função cerebral normal requer um suprimento suficiente e eficiente de oxigênio e nutrição pelo fluxo sanguíneo em uma complexa rede de vasos. A atividade cerebral local e o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) são acoplados de forma robusta, dependendo das propriedades funcionais dos neurônios, astrócitos, pericytes, células musculares lisas (SMCs) e células endoteliais (ECs)1. Recentemente, as primeiras poucas ordens dos capilares que ramificaram-se das arteríolas penetrantes emergiram como um ' hotspot '2, mostrando a regulação ativa do fluxo sanguíneo capilar. Uma resposta vascular conduzida lenta (CVR) foi descoberta neste ' hotspot ' no córtice somatosensory do rato durante a estimulação do whisker e a ejeção local (sopro) do ATP com uma micro-pipeta de vidro3.
Embora a imagem latente in vivo pela microscopia fluorescente da exploração do laser do dois-fóton seja usada extensamente estudando respostas neurovascular no córtice cerebral, a maioria dos estudos mediram diâmetros do vaso sanguíneo e investigaram seu regulamento em um plano de x-y bidimensional (2D). Os desafios são: em primeiro lugar, os vasos sanguíneos cerebrais e seus astrócitos abraçando, pericitos e SMCs constroem ramos em três dimensões (3D). Portanto, é crucial estudar suas interações em 3D. Em segundo lugar, mesmo uma pequena quantidade de deriva em foco afetará a medição precisa de ambos os diâmetros dos vasos e sinais fluorescentes celulares. Finalmente, os CVRs são rápidos e de longo alcance em três dimensões. a digitalização em volume 3D é ideal para detectar CVRs e revelar seus mecanismos. Nós implementamos um objetivo motor piezo em um microscópio do dois-fóton para estudar o córtice somatosensory do rato in vivo, permitindo medidas precisas do diâmetro por projeções da intensidade máxima das imagens obtidas.
As micro-pipetas de vidro têm sido freqüentemente usadas para estudos cerebrais in vivo, por exemplo, para corantes orgânicos de carga a granel4, registro EEGs5 e para fixação de remendo6. No entanto, as limitações permanecem. Comumente, a ponta da micropipeta de vidro é colocada imprecisamente, ou a micropipeta não é usada para intervenções locais. Aqui, otimizamos o procedimento de inserção de micropipeta e ejeção local.
Além disso, a combinação da microscopia do dois-fotão 3D e de indicadores fluorescentes genetically-codificados oferece uma oportunidade sem precedentes de investigar o acoplamento neurovascular em um espaço 3D. Neste estudo, nós aproveitamos este e injetou vetores virais que carreg indicadores genetically-codificados específicos do cálcio do astrocyte no córtice somatosensory do rato. Os astrocytes assim como os diâmetros da embarcação foram imaged simultaneamente combinando marcadores fluorescentes diferentes.
No geral, apresentamos um método otimizado de ejeção local (soprando) por micropipeta de vidro e imagem de hiperpilha de dois fótons rápido, que permite a medição precisa das alterações do diâmetro capilar. Além disso, nosso método fornece uma nova ferramenta para estudar simultaneamente os perfis 3D de CA2 + respostas em astrócitos e respostas de diâmetro vascular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1162">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">Sigma&#8211;Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A6138</td>
			<td style="width:524px;">Apply upon exposed cortex for protection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>Stain puffing compound to red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue and activator</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Adhesives and SF7452</td>
			<td>Glue for metal piece and coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:263px;">Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Keep the mouse eyes moisterized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">FD500S</td>
			<td>Blood serum dye, green fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NG2DsRed mice</td>
			<td style="width:263px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:152px;">8241</td>
			<td style="width:524px;">These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:152px;">52924-AAV5</td>
			<td>Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">52194</td>
			<td>Blood serum dye, red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Equipments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Air pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Give air pressure to pipette puffing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood gas analyzer</td>
			<td style="width:263px;">Radiometer</td>
			<td>ABL 700</td>
			<td>Measure levels of blood gases&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood pressure monitor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BP-1</td>
			<td>Monitor aterial blood pressure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Body temperature controller</td>
			<td>CWE</td>
			<td>Model TC-1000</td>
			<td>Keep the mouse body temperature in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Capnograph</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Type 340</td>
			<td>Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Electrical stimulator</td>
			<td style="width:263px;">A.M.P.I.</td>
			<td>ISO-flex</td>
			<td>Apply whisker pad stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Mechanical ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>D-79232</td>
			<td>Mechanically ventilate the mouse in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:263px;">Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Femtonics Ltd</td>
			<td>Femto3D-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical tweezer&#160;</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled and balanced tweezer</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>00595 FRAS-18 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris scissor</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>05-1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clamp</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse vascular catheters</td>
			<td>Verutech</td>
			<td>100828</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette

A manutenção da função cerebral normal requer um suprimento suficiente e eficiente de oxigênio e nutrição por uma complexa rede de vasos. No entanto, a regulação do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) é incompletamente compreendida, especialmente no nível capilar. A microscopia do dois-fotão é uma ferramenta poderosa amplamente utilizada para estudar CBF e sua regulação. Atualmente, este campo é limitado pela falta de estudos in vivo de microscopia de dois fótons examinando (1) respostas de CBF em três dimensões, (2) realizaram respostas vasculares e (3) intervenções localizadas dentro da rede vascular. Aqui, nós descrevemos um método de in vivo 3D usando a microscopia do dois-fotão para estudar as respostas vasculares conduzidas eliciadas pela ejeção local do ATP com uma micro-pipeta de vidro. Nosso método usa a imagem latente rápida e repetitiva do dois-fotão do hyperstack que fornece medidas precisas do diâmetro pela projeção da intensidade máxima das imagens obtidas. Além disso, nós mostramos que este método pode igualmente ser usado para estudar respostas astrocytic do cálcio 3D. Nós igualmente discutimos as vantagens e as limitações da inserção de vidro da micro-pipeta e da imagem latente do hyperstack do dois-fóton.

Uma vez concluída a cirurgia, os camundongos foram transportados para microscópio de dois fótons (Figura 1a). Uma micropipeta de vidro contendo 1 mM de ATP foi inserida na proximidade do vaso sanguíneo de destino no local alvo (Figura 1B).
Nós executamos a imagem latente do hyperstack ao dar um sopro do ATP de 1 milímetro (Figura 2a, vídeo ...

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In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Nós apresentamos um procedimento local aperfeiçoado da ejeção usando uma micro-pipeta de vidro e um método rápido da imagem latente do hyperstack do dois-fotão, que permita a medida precisa de mudanças capilares do diâmetro e a investigação de sua regulação em três dimensões.

In vivo tridimensional microscopia de dois fótons para estudo conduzido respostas vasculares por ejeção ATP local usando uma micro-pipeta de vidro

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Este protocolo foi projetado para estudar as respostas vasculares lentas conduzidas em capilares cerebrais provocados pela ejeção local de ATP. A vantagem desta técnica é simular atividades sinápticas locais por ejeção local de pipeta e manter o escasso vaso em foco por microscopia 3D de dois fótons. Este método também pode ser usado para estudar neuroma cerebral e atividade gliana em repouso e mediante estimulação em três dimensões. Demonstrando o procedimento será Michael L

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K visualizações.  University of Copenhagen. Este protocolo foi projetado para estudar as respostas vasculares lentas conduzidas em capilares cerebrais provocados pela ejeção local de ATP. A vantagem desta técnica é simular atividades sinápticas locais por ejeção local de pipeta e manter o escasso vaso em foco por microscopia 3D de dois fótons. Este método também pode ser usado para estudar neuroma cerebral e atividade gliana em repouso e mediante estimulação em três dimensões. Demonstrando o procedimento será Michael L

Vídeo: In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Two-photon Imaging of Microglial Processes&#039; Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...