Para caracterizar totalmente um fenótipo microglial, é importante abordar a motilidade basal e direcional. Este protocolo pode ser usado para testar a motilidade direcional da microglia por imagens de dois fótons em fatias cerebrais de camundongos, usando interface de impressão 3D personalizada e câmaras de perfusão. Demonstrando o procedimento estarão Fanny Etienne, uma estudante de doutorado, e Vincenzo Mastriolia, um pesquisador de pós-doutorado, ambos de nossos laboratórios.
Pelo menos 30 minutos antes da dissecção, comece a borbulhar 70 mililitros de fluido cerebrospinal artificial de colina, ou aCSF de colina, no gelo. Adicione 150 mililitros de colina aCSF a 32 graus Celsius, com carbogen. Coloque um prato cristalizador de 200 mililitros com um ímã de barras em uma caixa de alimentos selada e adicione 200 mililitros de aCSF ao prato.
Coloque um suporte de fatia de interface impresso em 3D em cima do prato e remova o excesso de fluido do prato cristalizador, até que apenas uma fina película de solução cobrindo a malha do suporte de slides da interface permaneça. Adicione alguns milímetros de aCSF na parte inferior da caixa de alimentos e comece a borbulhar o fluido com carbogen. Em seguida, feche a caixa selada mantendo a carbogenação constante para criar uma câmara de interface umidificada, 95%, 5% de dióxido de carbono.
Após a colheita, coloque o cérebro em um pedaço de papel filtro encharcado de aCSF e disseque a região de interesse, de acordo com o ângulo preferido do corte. Para fatias coronais, posicione e cole a face caudal do cérebro em uma placa de Petri de 10 centímetros presa ao bloco de corte de um cortador vibratório, e posicione o bloco na câmara do reservatório do cortador vibratório dentro de uma grande câmara cheia de gelo. Encha o prato com aCSF de colina gelada e use o cortador para obter fatias cerebrais de 300 micrômetros de espessura, usando uma pipeta descartável de transferência de quatro milímetros de diâmetro após cada passagem da lâmina para coletar cada fatia.
Deixe cada fatia se recuperar no aCSF de colina Celsius de 32 graus por cerca de 10 minutos após ser obtido, antes de transferir as fatias para pedaços de papel de limpeza da lente, coberto com uma gota de colina aCSF. Em seguida, aspire o excesso de colina aCSF e use uma espátula para transferir as fatias para a malha da câmara de interface, permitindo que as fatias se recuperem neste ambiente por pelo menos 30 minutos. 30 minutos antes de iniciar a gravação, conecte a bomba peristáltica a uma câmara de gravação personalizada com perfusão superior e inferior para otimizar a oxigenação e viabilidade das fatias de tecido, e limpe todo o sistema de perfusão com 50 mililitros de água ultrapura.
No final do ciclo de limpeza, inicie a perfusão da câmara de gravação com 50 mililitros de aCSF em um copo de vidro sob carbogenação constante, e use uma pipeta descartável de transferência de boca larga para transferir a primeira fatia a ser imageda ao béquer para remover o papel da lente. Quando a seção tiver afundado na parte inferior do béquer, transfira a seção para a câmara de gravação e posicione o suporte da fatia sobre a fatia para minimizar o movimento induzido pelo fluxo de perfusão. Use iluminação de campo brilhante para atingir a região cerebral de interesse sob uma ampliação de 5 a 10x.
Em seguida, use um objetivo de 25x com uma lente de imersão de água de 0,35x para ajustar a posição do campo de visualização. Use iluminação de fluorescência para localizar as células microgliais fluorescentes e enchimento da pipeta com 10 microliters de aCSF contendo o composto de interesse em sua concentração final. Aponte a ponta para baixo com um tremor suave para remover quaisquer bolhas de ar presas na ponta e monte a pipeta preenchida em um suporte de pipeta conectado a uma seringa de cinco mililitros com o êmbolo posicionado na posição de cinco mililitros e montado em um micromanipulador de três eixos.
Abaixe a pipeta suavemente em direção à fatia, controlando e ajustando o objetivo ao mesmo tempo, até que a ponta da pipeta toque levemente a superfície da fatia. Agora sintonize o laser e mude o microscópio para o modo multifotônio. Certifique-se de que a câmara seja rastreada a partir de qualquer fonte de luz e ligue os detectores não descansados.
Defina o ganho e use uma tabela de imagens com um limite superior codificado por cores para evitar saturar os pixels na imagem. Em seguida, comece a gravar por uma duração total de pelo menos 30 minutos, lentamente deprimindo o êmbolo da seringa da posição de cinco para um mililitro, após cinco minutos, durante um período de cinco segundos, para aplicar o composto na seção. Para análise de imagem, primeiro realize a projeção z e correção de deriva com ImageJ no arquivo de interesse.
Em seguida, abra o arquivo modificado em Icy e desenhe uma região circular de 35 micrômetros de diâmetro de interesse, centrada sobre o local da injeção. Execute o filme novamente com o ROI, para garantir que ele esteja bem posicionado. Em seguida, use a região de evolução de intensidade de interesse plugin para medir a intensidade média ao longo do tempo na região de interesse, e salvar os resultados como um arquivo xls.
Este protocolo permite que as respostas induzidas por diferentes compostos, como ATP ou serotonina, sejam medidas. Embora a injeção de ATP provoque um aumento da fluorescência, após a maioria das injeções de ATP, há uma ligeira diminuição imediata da fluorescência devido à distorção tecidual que volta após alguns minutos. O tamanho da região de interesse também impacta na quantificação, pois o aumento do diâmetro reduz a variabilidade entre os experimentos, mas diminui a precisão e a magnitude da resposta detectada.
A avaliação da resposta microglial em um ponto de tempo específico pode ser útil para a comparação estatística de diferentes compostos, ou para testar os efeitos de antagonistas específicos adicionados à solução de perfusão. Para quantificar a motilidade em três dimensões, saiba que você pode ter que alterar o intervalo de etapa z e a taxa de amostragem da aquisição para se encaixar dentro dos requisitos de análise.
