Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da microbiologia, como entender as mudanças na expressão genética em milhares de células únicas após uma lesão ou uma doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite dissecar transcritos de células individuais dentro de um tecido complexo, e apreciar melhor a dinâmica funcional dentro de uma determinada população. A vantagem do nosso protocolo é que ele fornece métodos abrangentes, desde o isolamento de células únicas nos tecidos primários, até a análise e visualização desse conjunto de dados.
Embora este método comece a partir de suspensões unicelulares da pele e do nervo, os métodos de sequenciamento que descrevemos podem ser aplicados para estudar qualquer tecido mamífero. Demonstrando este procedimento serão Elodie Labit, e Wisoo Shin, dois estagiários do meu laboratório. Para começar, dissecar o nervo ciático de um rato eutanizado cortando a pele pela primeira vez da região traseira da parte de trás do rato.
Use uma lâmina de bisturi estéril para fazer uma incisão ao longo do comprimento da coxa. Em seguida, use fórceps finos e tesouras para expor e remover o nervo ciático. Para dissecar a pele dorsal nas costas, use fórceps finos e tesouras para fazer incisões de ombro a ombro, através da garupa, e para baixo nas costas.
Lave os tecidos duas vezes com HBSS gelado. Sob um microscópio dissecando, remova tecido conjuntivo indesejado, depósitos de gordura ou detritos. Somente para a pele, corte a pele em fatias finas, usando uma lâmina de bisturi estéril.
Para obter a dermis da pele, flutue as fatias de pele em dispase, em HBSS em um prato de 10 centímetros, por 30 a 40 minutos a 37 graus Celsius. Use fórceps finos para descascar e separar a epiderme da derme e, em seguida, descartar a epiderme. Em seguida, para pele e nervo, use um par de lâminas de bisturi estéreis para picar cada amostra em pedaços de um a dois milímetros.
Coloque os pedaços de tecido em descongelamento fresco, dois gramas por mililitro de colagenase fria-quatro enzima em um tubo cônico de 15 mililitros. Incubar cada amostra na enzima em um banho Celsius de 37 graus por 30 minutos com agitação suave a cada 10 minutos. Aos 30 minutos, use uma pipetter P1000 para triturar o tecido 20 a 30 vezes, e retornar ao banho de água.
Repita a trituração a cada 30 minutos até que a solução pareça turva, e pedaços de tecido são em grande parte dissociados. Somente para a pele, na última hora de incubação, adicione um miligrama por mililitro DNAse à amostra de pele. Uma vez que alguns tipos de células são mais sensíveis do que outros ao estresse mecânico, técnicas excessivas de dissociação podem influenciar sua população.
A dissociação geral é fundamental para alcançar altos rendimentos celulares e uma representação precisa da composição tecidual. Depois disso, use um filtro de 40 micrômetros em cima do tubo cônico de 50 mililitros para filtrar cada amostra de tecido duas vezes. Enxágüe o filtro com 1% de BSA/HBSS.
Depois de centrifugar as amostras como descrito no manuscrito, suspenda a pelota celular no HBSS, contendo um por cento de BSA, usando uma ponta larga, e coloque no gelo. A adição de corante de viabilidade ajudará você a otimizar sua preparação. Você deve mirar em pelo menos 80% de células viáveis.
Uma vez otimizadas, esta e outras etapas de controle de qualidade podem ser omitidas para acelerar o processo de dissociação, o que preservará melhor a qualidade do RNA e reduzirá a perda celular. Para isolar células viáveis e saudáveis usando FACS, primeiro prepare tubos de fundo estreito de 15 mililitros com oito mililitros de gelo de 1% de BSA/HBSS para coletas de amostras. Para garantir que a interface entre a superfície do líquido e o interior do tubo esteja úmida, e para evitar tensão estática e superficial, inverta os tubos antes das coletas.
Imediatamente após a triagem celular FACS, uma vez que as células são coletadas em um tubo de 15 mililitros, use um mililitro de um por cento de BSA/HBSS para lavar e empurrar todas as células para baixo da superfície lateral do tubo. Em seguida, centrifugar cada amostra a 260 g por oito minutos. Depois de descartar o supernascer, suspenda a pelota celular em um por cento BSA/HBSS, e adicione 33,8 microliters a um tubo, e mantenha esse tubo no gelo.
Esta etapa foi projetada para ser feita utilizando reagentes obtidos a partir de um kit padronizado. Todas as etapas demonstradas devem ser executadas seguindo as instruções do fabricante. Para se preparar para a geração GEM, coloque um chip no suporte do chip, prepare uma mistura mestre de células no gelo, de acordo com o protocolo do fabricante.
Adicione 56,2 microliters da mistura mestre a um tubo contendo 33,8 microliters de auto-suspensão. Para preparar o chip, primeiro com 50% de glicerol para os poços que não serão usados. Em seguida, adicione 90 microliters da mistura mestre celular a bem um, 40 microliters de contas de gel para bem dois, e 270 microliters de óleo particionário para bem três.
Cubra o chip com uma junta. Para carregar o chip e executar em um controlador de célula única, primeiro ejete a bandeja. Coloque o chip na bandeja.
Retraia a bandeja e pressione play. Após a execução completa, colete 100 microliters da amostra e coloque em um tubo PCR. Coloque tubos PCR em uma máquina PCR predefinida e execute de acordo com o kit.
Após a execução, os GEMs incluirão cDNA de código de barras completo, a partir de mRNA poliadenylated. Coloque os tubos a menos 20 graus Celsius durante a noite. Prossiga com construção de biblioteca, sequenciamento, alinhamento e análise.
Uma vez que as amostras são sequenciadas e alinhadas como descrito no manuscrito, deposite os dados em um repositório público, como o GEO do NCBI. Para isso, cadastre-se para a conta do inscrito. Primeiro, complete a submissão GEO baixando a folha de metadados.
Certifique-se de incluir apenas uma folha de metadados por submissão do projeto. Coloque a planilha no diretório. Em segundo lugar, adicione o arquivo de dados bruto gerado a partir do script de contagem de células-ranger para todas as bibliotecas no diretório.
A terceira pasta é arquivos de dados processados. Coloque arquivos de dados processados gerados a partir do script de contagem de células-ranger para todas as bibliotecas no diretório. Use as credenciais do servidor FTP do subsedor GEO para transferir o diretório contendo os três componentes.
Depois de executar o Cell Ranger, as matrizes de código de barras genética prontas para análise podem ser processadas usando bioinformática avançada. Primeiro, foram feitas verificações de quantidade pré-processamento usando o pacote Seurat R, que gerou tramas de violino e dispersão para visualizar o número de genes, número de identificadores moleculares únicos e porcentagem de genes mitocondriais para identificar dobras celulares e outliers. Para seleção dos componentes principais, ou PCs, foram utilizadas parcelas de cotovelo, nas quais foram excluídos PCs além do platô do desvio padrão do eixo PC.
A resolução do agrupamento também foi manipulada. A baixa resolução levou a menos aglomerados celulares, com cada aglomerado provavelmente representando um tipo de célula definida. A alta resolução levou a maior probabilidade celular, representando subtipos, ou estados transitórios, de uma população celular.
Foram utilizadas configurações de cluster de baixa resolução para análise posterior de mapas de calor de expressão para identificar os genes mais altamente expressos em um determinado cluster. Genes de candidatos individuais foram visualizados em parcelas do TSNE, usando a função de enredo de Seurat, que permitiu decifrar, se havia aglomerados que representavam, por exemplo, macrófagos. Ambos o cluster dois e quatro expressaram CD68, um marcador pan-macrófago.
Outros pacotes também fornecem ferramentas para controle de qualidade, por exemplo, o Monóculo, um pacote R usado para a construção de trajetórias celulares, remove células de má qualidade e garante que a distribuição de mRNA em todas as células seja normal e entre os limites superior e inferior. As células únicas foram então classificadas e contadas, usando genes marcadores de linhagem conhecidos, e as células expressando marcadores de interesse foram atribuídas ao tipo celular número um. Foi determinado que o tipo celular número um eram fibroblastos.
Essa população foi avaliada para construir trajetória de desenvolvimento de fibroblastos. Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativo, hibridização in situ, uma química imunista deve ser realizada para validar a precisão dos resultados da expressão genética. O sequenciamento de mRNA unicelulares abriu agora o caminho para pesquisadores em muitos campos diferentes explorarem a heterogeneidade célula-celular, e identificar dinâmicas funcionais dentro de diferentes tecidos durante a homeostase, e como estes podem mudar após lesões ou no desenvolvimento de doenças.
