Esta técnica permite não apenas a localização, mas também a quantitação de mRNAs candidatos nos oócitos e embriões individuais. Em comparação com outros ensaios, incluindo PCR, a conclusão da técnica resulta em dados reprodutíveis com baixa variação. Demonstrando o procedimento será Kelsey Timme, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório.
Inicie este procedimento com a preparação do material necessário e camundongos fêmeas com cinco a oito semanas de idade, conforme descrito no protocolo de texto. Limpe o mouse usando 70% de etanol. Exponha a cavidade abdominal e visualize o trato reprodutivo feminino.
Segure o ovário com fórceps e remova os ligamentos uterinos e o excesso de tecido adiposo ao redor do ovário. Corte o oviduto do útero. Em seguida, coloque o par de oviduto de ovário em meio de espera quente em um prato de 35 milímetros.
Remova o ovário e qualquer tecido adiposo circundante. Rasgue a ampola inchada do oviduto usando uma agulha calibre 27 de meia polegada. Empurrar o oviduto no local dos complexos de oócito de células lacrimejadas e cumulus será expulso.
Usando uma pipeta bucal para transferir os oócitos ovulados para a gota de 100 microliteres contendo meio de retenção com hialuronidase. Para desalojar as células cumulus, pipeta a metafase dois complexos de células cumulus oocyte para cima e para baixo na hialuronidase contendo meio de retenção com a pipeta bucal. Uma vez desprovidos de células cumulus, use a pipeta bucal para transferir cada oócito para uma gota de lavagem contendo apenas meio de retenção.
Repita isso para cada gota de lavagem. Não transfira oócitos fragmentados ou transparentes. Para realizar a coloração SM-FISH, fixe primeiro osócitos em um poço individual de uma placa de seis poços contendo 500 microliters de tampão de fixação.
Submergir 20 oócitos ou menos no poço. Incubar os oócitos no tampão de fixação por 20 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar os oócitos como descrito no protocolo de texto, incubar oócitos em tampão de permeablização por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após outra lavagem, transfira os oócitos para 80 microliters de protease pré-diluída três tampão por 30 minutos em temperatura ambiente. Diluir os conjuntos sondados aquecidos para Nanog, Pou5f1 e DapB de um a 50 em diluente da sonda. Incubar oócitos em 80 microliters da sonda específica da transcrição por duas horas a 40 graus Celsius.
Quando os oócitos estão na sonda e os buffers AMP, eles tendem a flutuar. É essencial que você submerse os oócitos empurrando-os suavemente para dentro do buffer. Transfira os oócitos para 500 microliters de tampão de lavagem e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
Agora, incubar oócitos sequencialmente em tampões de amplificação. Primeiro, incubar oócitos em 80 microliters de AMP1 por 30 minutos a 40 graus Celsius. Em seguida, transfira os oócitos para 500 microliters de tampão de lavagem por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, incubar oócitos em 80 microliters de AMP2 por 15 minutos a 40 graus Celsius. Depois de lavar os oócitos como antes, incubar os oócitos em 80 microliters de AMP3 por 30 minutos a 40 graus Celsius seguido de uma lavagem final. Por fim, adicione oócitos a 80 microliters de AMP4FL por 15 minutos a 40 graus Celsius.
Pipeta 12 microliters de meio de montagem anti-fade no centro de um slide sem adicionar bolhas ao reagente. Transfira oócitos com o mínimo de tampão de lavagem possível para o meio de montagem. Por fim, aplique um recibo de cobertura.
Imagem dos oócitos tridimensionais usando microscopia confocal passo Z e salve as imagens conforme descrito no protocolo de texto. Arraste arquivos ND2 para Fiji e escolha Hyperstack. Clique na guia Imagem, selecione Cores e clique em Canais divididos para separar os canais fluorescentes do arquivo ND2.
Gerar arquivos TIFF individuais para cada fatia Z dos oócitos em cada canal fluorescente. Para isso, clique na guia Imagem, selecione Pilhas e clique em Pilha para Imagens. Em seguida, clique na guia Imagem, selecione Digite e clique em Cor RGB para converter cada fatia Z em uma imagem de cor RGB individual.
Salve cada imagem convertida como um arquivo TIFF. Coloque imagens de um único oócito para cada canal fluorescente em uma nova pasta para evitar confusão durante a costura. Depois de normalizar os arquivos conforme descrito no protocolo de texto, clique na guia Plugins, selecione Costurar e clique em Coleta de grade.
Selecione Imagens Sequenciais no menu suspenso e clique em Ok. Navegue pelo diretório e selecione a pasta contendo todas as imagens da fatia Z para um oócito individual em um comprimento de onda. Clique em Ok.
Mova o controle deslizante na parte inferior da imagem costurada para o canal de cores apropriado para o comprimento de onda usado. Crie a imagem final costurada RGB clicando em Imagem, selecionando Tipo e clicando em Cor RGB. Converta a imagem costurada em uma imagem máxima projetada de 32 bits.
Para isso, clique em Imagem, selecione Digite e clique em 32 bits. Salve esta imagem como um novo arquivo TIFF. Abra a imagem costurada de 32 bits em um programa de localização e rastreamento de pontos.
Selecione a dropdown localize e clique em Localize, que calculará o número de pontos encontrados na imagem. Mostrado aqui é a quantificação de mRNAs usando o localizador de manchas e rastreamento. A seta azul aponta para um sinal positivo acima do limiar.
A seta branca mostra um ponto fluorescente abaixo do limiar e, portanto, não contado. As contagens de mRNA foram posteriormente analisadas por meio de uma ferramenta padrão de análise de dados. Imagens representativas da imagem da série Z média são mostradas para Pouf51 e Nanog.
A coloração da DAPI de cromossomos alinhados no fuso metafásico dois é mostrada em branco. Os dados coletados neste protocolo mostraram 775 transcrições de Pouf51 e 113 transcrições de Nanog em metafase dois oócitos. É importante ressaltar que não foram detectadas manchas nos oócitos que são rotuladas com sonda DapB, que serviu como controle negativo.
Ao usar células não aderentes, é importante identificar empiricamente a melhor diluição do tampão protease do kit SM-FISH. A detecção de mRNA foi testada usando uma curva de titulação de concentrações tampão de protease diluídas e várias diluídas em 1xPBS. A diluição protease utilizada neste protocolo foi de um a oito, pois apresentou a menor variação na expressão fluorescente média de Pouf51 mRNA em dois oócitos metafásico.
A imuno-fluorescência simultânea de uma proteína-alvo pode ser realizada a fim de co-localizar o mRNA com uma proteína de ligação de RNA. A co-localização dos mRNAs com as proteínas de ligação RNA permite que os pesquisadores determinem mecanismos que regulam o armazenamento, a tradução e a degradação do mRNA dentro de um oócito ou embrião.
