Nosso protocolo para um ensaio de luciferase in vitro transcrito baseado em RNA ajuda a estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo vírus da varíola. Além disso, um comprimento personalizado do poly(A)litro permite estudar seus efeitos regulatórios na tradução. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo da regulação da tradução por elementos cis como 5'UTR e 3'UTR em mRNA e amplo espectro de iniciação de tradução.
O ensaio de repórter luciferase in vitro transcrito baseado em RNA pode ser adaptado para incorporar modificações na tampa e outras modificações e usado para testar o efeito na tradução. Para começar, projete primers para frente e para trás para gerar amplicon PCR contendo os seguintes elementos em 5'to 3'direction:T7-Promoter, Poly(A)litro, Firefly Luciferase ORF em uma cauda Poly(A)referida como T7_12A-Fluc, incluem vários nucleotídeos extras no primer dianteiro seguidos de T7-Promoter Poly(A)liter ou sequência desejada de 5'UTR e aproximadamente 20 nucleotídeos correspondentes ao final do ORF do gene repórter. Ajuste o comprimento do primer com base na temperatura de fusão correspondente ao orf do gene repórter, garantindo que a região correspondente no primer seja idêntica à cadeia de sentido do gene.
Em seguida, projete o primer reverso para incluir a cauda Poly(A) e aproximadamente 20 nucleotídeos. Ajuste com base na temperatura de fusão correspondente ao ORF de 3'end do gene repórter garantindo que a região correspondente do primer seja idêntica à cadeia antissamante do gene e um códon de parada no quadro esteja presente antes da cauda Poly(A)." Para controle interno, projete outro conjunto de primers contendo os seguintes elementos em 5'to 3'direction:T7-Promoter, uma sequência aleatória de codificação utr de 5'UTR contendo sequência Kozak, Renilla Luciferase ORF e cauda Poly(A),referida como T7_Kozak-Rluc.
Para configurar a reação, adicione reagentes na seguinte ordem a um tubo PCR:DNase água livre, polimerase de DNA de alta fidelidade 2X, primers e sequência confirmada DNA modelo de luciferase. Após um ciclo PCR padrão de três etapas para gerar um modelo de DNA, detecte o produto PCR executando 5-10% da reação do PCR em uma eletroforese de gel TAE de 1% agarose, juntamente com um padrão de peso molecular. Para determinar o tamanho do produto PCR, visualize o gel sob um iluminador UV.
Depois de determinar o tamanho correto do produto PCR, purifique-o usando um kit de purificação PCR comercialmente disponível usando 100 microliters de água livre nuclease para elutar o DNA. Verifique a concentração do DNA purificado usando um espectotômetro e armazene-o a menos 20 graus Celsius para uso para transcrição in vitro imediatamente. Para sintetizar o RNA do produto PCR, adicione os seguintes reagentes a um tubo de microcentrifuuge: água livre DNase-RNase, mistura de tampão NTP, analógico da tampa, modelo de produto PCR e mistura de polimerase T7-RNA do kit de transcrição in vitro.
Homogeneizar. Incubar a 37 graus Celsius por duas horas e, em seguida, proceder para a purificação do RNA sintetizado usando um kit de purificação de RNA. Para verificar o RNA purificado, aqueça o RNA a 70 graus durante cinco minutos para remover a estrutura secundária e executá-la em gel TBE de 1,5 agarose.
Em seguida, visualize o gel sob um iluminador UV. Verifique a concentração do RNA purificado usando um espectotômetro. Aliquot-lo e armazenar a menos 80 graus Celsius.
Sementes HeLa células em uma placa de 24 poços para alcançar 80-90% de confluência no dia seguinte e incubar durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Infectar células HeLa com vírus Vaccinia em uma multiplicidade de infecção de cinco e manter células HeLa não infectadas para comparação. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 a 12 horas.
Após horas desejadas após a infecção, misture 480 nanogramas de sequência 12A com mRNA Firefly Luciferase e 20 nanogramas de sequência kozak com renilla Luciferase mRNA em um tubo de microcentrifuuge. Em outro tubo de microcentrifuge, adicione 1,1 microliters de reagente de transfecção lipídica cationic. Adicione 55 microliters de mídia súmumlica reduzida aos dois tubos, misture e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, adicione 55 microliters reagente de transfecção lipídica cationic contendo mídia de soro reduzido ao tubo contendo mRNA. Misture suavemente, mas bem com uma pipeta e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Durante a incubação, remova o meio de cultura celular das células e adicione 400 microliters de meio soro reduzido por poço.
Quando a incubação estiver concluída, adicione 100 microliters da mistura, queda sábia e uniformemente por poço da placa de 24 poços. Cinco horas após a co-transfecção com 12A Fluc e Kozak Rluc mRNA, remova o meio sérico reduzido das células e lise as células adicionando 150 microliters 1X lysis tampão do kit de ensaio luciferase capaz de realizar dois ensaios repórteres. Depois de incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, raspe as células usando borracha e seringa estéril e transfira para um tubo de microcentrifuge.
Para detritos de células de pelota, centrifugar o lysate a 12.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 30 microliters de supernascer por poço de uma placa de ensaio 96 bem branca murada com um fundo sólido. Use o kit de ensaio luciferase e um luminômetro leitor de placas multi-modo para medir a luminescência dupla usando a função cinética como descrito no manuscrito.
Depois de exportar os dados de leitura de luminescência em um formato de arquivo desejável, determine a taxa de tradução relativa de 12A Fluc mRNA em células HeLA não infectadas e VACV infectadas dividindo o valor Fluc por controle interno valor Rluc. Este ensaio foi usado para testar a eficiência de tradução de um mRNA Fluc que contém um 5'Poly(A)litro em células infectadas não infectadas e VACV. Ambas as células infectadas não infectadas e vacv foram co-transinfetadas com fluc e rluc mRNA.
A divisão do Fluc por Rluc normalizou a eficiência de transfecção na estabilidade do RNA nas células. 5'Poly(A)litro contendo mRNA tem uma vantagem translacional durante a infecção pelo VACV em comparação com células não infectadas. Isso não foi devido à eficiência diferenciada de transfecção ou estabilidade do mRNA, uma vez que o nível de RNA foi semelhante em células infectadas pelo VACV cinco horas após a transfecção do mRNA.
Tome cuidado especial ao projetar primers, pois isso pode afetar não apenas a eficiência de reação do PCR, mas também todos os processos a jusante que requerem o DNA amplificado. Este método é um importante ensaio para testar rapidamente o regulamento de tradução por elementos Cis. Se possível, esse método deve ser corroborado por outros experimentos complementares.
Deve-se tomar precauções ao usar o vírus vaccinia e evitar a exposição a produtos químicos como brometo de ethidium e fenol.
