Nosso protocolo nos permite visualizar como as células marcadas fluorescentes respondem a um estímulo periférico inflamatório em um animal vivo em tempo real. 2-A imagem de fóton permite a visualização profunda no tecido de um espécime vivo, preservando a integridade de suas células e seu microambiente e fornecendo uma representação precisa do sistema biológico. Respirar move a pata ao longo do tempo, causando embaçamento e perda do plano focal.
Certifique-se de fixar firmemente a pata com fita adesiva em uma superfície estável antes da imagem. Neste, você deve ser capaz de encontrar plano de interesse apropriado, certificar-se de que o objetivo está perto da pata sem tocar e está diretamente acima do local de injeção. Antes de iniciar o procedimento, ligue o sistema multifóton e selecione o subjetivo 25X.
Coloque um aparelho estereotaxo no palco do microscópio multifóton e conecte o aparelho a uma máquina de entrega de anestesia. Coloque um pedaço de papel preto fosco na superfície do aparelho como um ponto de conexão para a pata do rato. Defina o scanner de ressonância com uma área fixa de varredura de 512 por 512 micrômetros.
Sintonize os lasers de excitação nos comprimentos de onda de excitação de 930 e 1.100 nanômetros para sinais de proteína fluorescente verde e vermelho, respectivamente. Use um espelhodicróico de 690 a 1.050 nanômetros para direcionar o caminho de luz de ambos os lasers de excitação para o único objetivo permitindo que o laser de excitação afinado de 930 nanômetros seja refletido no scanner principal e no laser de 1.100 nanômetros para passar diretamente para o scanner principal. Em seguida, defina a potência laser do FITC para 5% e a proteína fluorescente verde para 20% e desligue as luzes aéreas.
Para imagens in vivo, anestesiar o mouse e delinear no protocolo de texto. Confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo no mouse anestesiado e coloque o mouse no aparelho estereotaxico com acesso a um cone de nariz. Use fita preta para fixar firmemente a pata traseira ao pedaço de papel preto em áreas proximais e distais à área de interesse, certificando-se de que a superfície plantar da pata está desobstruída e voltada para o objetivo.
Coloque uma quantidade generosa de lubrificante à base de água na superfície plantar da pata. Toque o objetivo do lubrificante para criar uma coluna de líquido entre a pata e o objetivo. Use a luz de excitação FITC para se concentrar na camada dérmica da pata, confirmando que os fibroblastos de tomate marcados por tandem podem ser visualizados.
Imagem a área de células localizada logo abaixo da superfície plantar da pata traseira com ambos os lasers. Adquira um lapso de tempo de 15 minutos de cerca de cinco a 10 fatias Z a aproximadamente um micrômetro por fatia para estabelecer uma representação de linha de base do ambiente. Quando a imagem da linha de base tiver sido obtida, carregue uma seringa Hamilton de vidro de 25 microlitrados com cinco microgramas de lipopólise conjugada FITC, ou LPS, por 20 microliters de PBS.
Administre a solução por injeção intraplantar na pata traseira experimental sem perturbar a posição da pata. Em seguida, imagine uma área de células localizada logo abaixo da superfície plantar da pata traseira com ambos os lasers. Adquira um lapso de tempo de 60 a 120 minutos de cerca de cinco a 10 fatias Z a aproximadamente um micrômetro por fatia para identificar a absorção intraplantar mediada por célula do LPS FITC.
Como não há fluorescência inerente pelas células dentro da camada dérmica, uma miríade de células na camada dérmica da pata traseira pode ser observada tomando LPS fluorescentemente marcado após injeção intraplantar em um rato tipo selvagem. Após a injeção de LPS FITC, apenas a proteína específica do fibroblasto um fibroblasto positivo expressando pedágio como receptor quatro liga e absorva a proteína injetada com um alto nível de co-localização com uma tag de tomate tandem dimer expressa por essas células. Em contraste, camundongos que têm pedágio como receptor quatro nocauteados fora de todo o corpo não se ligam e captam LPS após a injeção.
De fato, as silhuetas celulares são visíveis após a injeção de LPS FITC indicando que a droga está se dispersando no fluido intersticial ao redor das células, mas não está realmente sendo vinculada por um receptor. A coisa mais importante a ser lembrada neste protocolo é garantir que a pata seja imobilizada para que não haja distorções no vídeo devido ao movimento ou respiração. Usando este procedimento, o recrutamento de células fluorescentes marcadas para uma área após lesão e as alterações morfológicas na resposta de uma célula a um estímulo ao longo do tempo podem ser rastreados.
Assim, a imagem de 2-Fótons permite que os pesquisadores combinem ratos repórteres genéticos e compostos fluorescentes marcados para avaliar o que acontece em um animal vivo após uma injeção.
