Este protocolo foi desenvolvido em colaboração com os membros anteriores do Lab McGinnis, Kim A. Mace e Joseph C. Pearson. Agradecemos aos contínuos esforços do Bloomington Drosophila Stock Center para o seu trabalho de organizar e distribuir os estoques valiosos. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do National Institutes of Health (R01 GM077197 e K12 GM68524) ea família de Herbert Stern. MTJ é actualmente suportado por Grant Número 5G12RR003060-26 a partir do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e Número Grant 8G12MD7603-27, do Instituto Nacional de Saúde da Minoria e Saúde Disparidades. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional contra a minoria de Saúde e Saúde Disparidades ou o National Institutes of Health.

O protocolo ferida embrionário Drosophila pode ser resumido em cinco etapas: (1) coleta de embriões, (2) Preparação de Embriões (3) Embrião ferir, (4) microinjeção de embriões, e (5) Fixação de embriões. 1. De colheita de embriões <ol><li> Colete moscas adultas, 2-3 dias após eclosing, adicionar 50 fêmeas e 25 machos para uma gaiola de colheita de embriões. </li><li> Coloque um ágar suco de maçã fresca, mais placa de levedura, todas as manhãs, durante 3 dias. Notas: Para coleta de embriões ideal, ciclo das moscas em uma programação diurna de 12 horas em uma incubadora de 25 ° C (05:00 luzes &quot;ON&quot; e 17:00 luzes &quot;OFF&quot;); moscas fêmeas responder às mudanças no ciclo de luz e irá depositar grandes quantidades de ovos durante um interruptor das luzes &quot;ON&quot; para luzes &quot;OFF&quot; 10,11. </li><li> Na tarde do dia-3, coloque um suco de maçã fresco mais levedura placa de ágar na gaiola e coletar embriões para 2 horas. Coloque uma nova placa de levedura na gaiola e salvar o2 prato de coleta hr. </li><li> Armazenar a placa de recolha para uma 14 horas adicionais a 25 ° C a idade dos embriões. Notas: Cicatrização de feridas podem ser ensaiadas em qualquer fase de desenvolvimento da Drosophila, os repórteres de transcrição induzida por ferimentos descritos neste documento têm uma atividade ótima entre os estágios 15-16 dezembro. No final de estágio 17, o embrião é velho demais para furar facilmente a cutícula amadurecendo e ativar de forma eficiente os repórteres da ferida ou detectar a transcrição induzida pela ferida. Para permitir que o tempo de coleta eo tempo de ferir a ocorrer durante o horário de pico de laboratório, seguimos um cronograma de colheita de embriões para 2 horas (16:00-18:00), trocar a placa de coleção com um novo prato, às 18:00, a idade o prato de coleta, a 25 ° C, durante 14 horas (overnight), e ferindo os embriões às 08:00 (dia seguinte). </li></ol> 2. Preparação de embriões Notas: Este protocolo inclui o uso de muitas ferramentas e objetos que são nítidas ou feitas de gmoça. Manuseie todos os farelos e objetos de vidro com cuidado para evitar ferimentos. <ol><li> Remova cuidadosamente os embriões a partir de chapas de cobrança com um pincel, adicionando 2-3 ml de água para a chapa e de roda. Água e embriões Transferência de placa para malha de nylon e tubo de coleta. </li><li> Adicionar 4-5 ml de água sanitária para a tampa de uma placa de Petri prato de plástico e mergulhe a extremidade coberta malha do tubo de coleta contendo os embriões em água sanitária por 2 min, o que elimina a casca externa do embrião. Gire manualmente o tubo de coleta de um par de vezes para evitar que os embriões se aglomerem na lixívia. Enxágüe embriões com 10x de água e secar o tubo de coleta de malha coberta contendo os embriões dechorionated sobre uma toalha de papel. </li><li> Use uma agulha de dissecação para transferir ~ 50 embriões a partir de malha de nylon para uma placa de ágar. Nós adicionar corante alimentar verde para a placa de ágar para adicionar contraste e ajuda no alinhamento embrião. Sob um microscópio de dissecação, fazer duas fileiras paralelas de ~ 25 embriões, alinhando a embryOS no slide para que eles estarão em ângulo reto com a agulha de punção sobre o aparelho de microinjeção. Deixe um pouco de espaço (cerca de 1 embrião comprimento) entre os embriões para fins de troca gasosa. As duas linhas paralelas devem ser aproximadamente 5 mm. </li><li> Coloque um slide com fita dupla pau em cima dos embriões alinhados e pressione cuidadosamente o slide para transferir embriões a partir da placa verde para o slide. Em seguida, o ar seco os embriões ~ 25 min para reduzir a pressão interna sobre o embrião e evitar uma explosão quando ferindo. </li><li> Coloque 2-3 gotas de óleo de mistura de hidrocarbonetos halogenados sobre os embriões para evitar uma maior desidratação. </li></ol> 3. Embrião Wounding <ol><li> Coloque o slide embrião no estágio do microscópio injeção. Encontrar os embriões no campo de visão e pratica mover a fase de microscópio invertido. Notas: Antes de trabalhar com a agulha, se concentram em plano médio do embrião ao longo do eixo dorso-ventral. Para permitir o ferimento eficaz doembriões alinhados, começam ferindo a linha mais próxima do aparelho de agulha. Mover a etapa de levar a parte superior da linha de embriões alinhados no campo de visão. </li><li> Cuidadosamente colocar e fixar uma agulha puxado no porta-agulha. Use o micromanipulador para mover a agulha para baixo em direção slide. Alinhar a agulha com o embrião, no mesmo plano focal. Uma vez que a agulha está em foco com o embrião, não mova a agulha com o micromanipulador. </li><li> Mova o palco para perfurar o embrião por completo, em seguida, passar para a próxima embrião na linha. Quando terminar ferindo a primeira linha, use o micromanipulador para mover a agulha totalmente para cima e longe do palco, antes de passar a lâmina; rodar manualmente o slide 180 º e acabou a segunda fila. </li><li> Guarde os embriões sob óleo halocarbono à temperatura ambiente e proceder com a fixação do embrião, se fazendo de hibridização in situ ou coloração de anticorpos (ver Procedimento passo 5). Alternativamente, armazene os embriões para 4-6 hrsob óleo halocarbono e prosseguir com a visualização repórter fluorescente transcricional da ferida (resultados representativos). Notas: Para a visualização do repórter fluorescente, que anestesiar os embriões utilizando 50% de 1-fenoxi-2-propanol 13. Os embriões são retirados do óleo de hidrocarbonetos halogenados e colocado sobre uma nova lâmina. Colocamos contas de vidro em torno dos embriões, adicione algumas gotas de anestésico, e coloque uma lamínula sobre os embriões. </li></ol> 4. Embrião microinjeção Notas: O aparelho de microinjeção que usamos no protocolo não é automatizado para entregar volume específico durante o ensaio. Nós adicionar um corante para a solução de visualizar a microinjecção e tentar normalizar o volume entregue. Se demasiado solução é injectada no embrião, a membrana vitelina vai rebentar. <ol><li> Agulha de carga a partir da retaguarda, com 1 ml de solução química, mais corante (por exemplo, de 0,6 MH 2 O 2). Permitir capilaracção de introduzir a solução química para a ponta da agulha. </li><li> Para quebrar uma agulha, coloque uma lamínula em um ângulo em um slide e um casaco a borda com a mistura de óleo de hidrocarbonetos halogenados. Traga a agulha montada em foco com a borda da lamínula angular e gentilmente mover borda tampa de deslizamento através da ponta da agulha até quebrado. Aplique pressão no aparelho de microinjeção e verifique se a solução química além de corante está fluindo para fora da agulha. </li><li> Coloque o slide contendo embriões alinhados no palco microscópio. Continuar a concentrar-se o embrião e a agulha no mesmo plano. Simultaneamente perfurar e solução química microinject mais corante em cada embrião. Notas: agulhas entupidos ocorrem com freqüência; quebrar uma agulha nova para evitar microinjeção incompleto. A ponta da agulha sem corte não acabou tão limpa quanto uma ponta de agulha em ângulo. Ajustar a lamela para um não-ângulo de 90 ° durante a ruptura é ideal para produzir uma ponta de agulha em ângulo. </li></ol> 5. Formaldeído Fixation Notas: Os produtos químicos utilizados neste fixação Drosophila são prejudiciais. Usar equipamento de protecção individual (por exemplo, luvas, casaco de laboratório e óculos de segurança) ao manusear produtos químicos. Siga as orientações institucionais individuais para descarte de produtos químicos regulamentados. <ol><li> Depois de ferir, esperar 15, 30, 60 ou mais minutos para a ativação da transcrição de genes induzidos por ferida para ocorrer. Para remover embriões a partir de lâminas de injeção, escorra cuidadosamente a mistura de óleo de hidrocarbonetos halogenados dos slides, inclinar a lâmina contra um rack e apagar o final com um Kimwipe. </li><li> Use uma pipeta de vidro para lavar heptano sobre a lâmina e lavar o líquido de lavagem em uma placa de Petri de vidro. Heptano irá dissolver a fita e libertar os embriões. Continuar a enxaguar até que todos os embriões são removidos a partir do slide. Avance para o próximo slide, até que todos os embriões são removidos slides. </li><li> Transfira o heptano e solução embrião do prato de vidro em um sci 20 mlfrasco ntillation. Agitar o frasco para 2-3 min, retire o heptano e adicionar 5 ml de heptano fresco. </li><li> Adicionar 5 ml de fresco, a solução de fixação (ver lista reagentes para a receita). Tampe o frasco e anexar a um agitador de plataforma orbital. Agitar o frasco contendo os embriões durante 25 minutos a 220-230 rpm. </li><li> Após agitação, deixe que as bolhas no pop interface. Remover completamente a fase inferior, aquosa com uma pipeta, evitando puxar para cima os embriões. A camada inferior é constituída por a solução de fixação e deve ser descartado de forma apropriada. </li><li> Adicionar 5 ml de metanol, tampar o frasco e agitar vigorosamente à mão por 20-30 seg, redemoinho e colocá-lo no banco. Embriões Feridos vai ficar no interfase e não vão para o fundo. Notas: Após a fixação da membrana vitelina de um embrião sem ferimentos normalmente estourou durante a etapa de desidratação com metanol. No entanto, a membrana vitelina em um embrião ferida já é quebrada e o passo de desidratação não irá remover o memb vitelinaRane. Mão-devitellinzation é necessário para completar o protocolo de fixação. </li><li> Com cuidado, retire a camada de heptano superior e, em seguida, adicionar 5 ml de metanol fresco. Agitar o frasco e os embriões devem afundar. </li><li> Remover o metanol e solução embrião com uma pipeta de vidro e recolher em um tubo de coleta de malha de nylon em um prato de vidro. </li><li> Remover o metanol e lavar os embriões com uma solução de PBS 1x. </li><li> Transferir os embriões a partir da malha de nylon para uma placa de sumo de maçã. Espalhe os embriões fora ao longo da superfície da placa. </li><li> Transferir os embriões para uma lâmina de vidro fita dupla vara. Cobrir os embriões com 1x PBS. Notas: Os embriões tendem a aglutinar-se por causa da membrana vitelina. Usando um local suco de maçã permite a separação rápida dos embriões agregada. Os embriões devem ser removidos a partir da placa e transferidas para uma lamela de vidro de fita de dupla face, porque os embriões afundar na placa de ágar, quando é aplicada força para remover o embrião amembrana vitelina. </li><li> Empurre cuidadosamente os embriões com uma agulha de dissecação de &quot;pop&quot; a membrana vitelina. O embrião deve afundar no PBS. </li><li> Usar uma pipeta para transferir o vidro 1x PBS mais embriões para um tubo de 1,5 ml. Lavar os embriões com PBS 1x e armazenar a 4 ° C. Prossiga para desidratar os embriões utilizando uma Etanol: Série PBS e continuar com a hibridização in situ ou protocolo imunolocalização 14. </li></ol>

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Uma resposta regulatória transcricional imediato a estímulos externos permite que as células para coordenar uma resposta localizada a estímulos extracelulares, que podem incluir o estresse, dano ou infecção. O controle indevido de uma resposta localizada pode ter efeitos nocivos sobre as células vizinhas, bem como um desperdício de recursos para reparar a lesão. O embrião Drosophila fornece um sistema excelente para conduzir experimentos básicos cicatrização de feridas em um modelo de manter fácil organismo barato e. O potencial para a colaboração entre a investigação em outros organismos modelo e Drosophila oferece uma oportunidade única para explorar muitas questões biológicas. Uma técnica adicional dos repórteres da ferida é a combinação genética de fundos mutantes, fornecendo um método eficiente para testar a contribuição de novos genes para a ativação da via de resposta epidérmica ferida. Temos repórteres transcricional induzida por feridas epidérmicas avdisponív eis tanto no 2 º e 3 º cromossomos 5. Neste estudo utilizamos UAS e sistemas GAL4 de superexpressão 16. Para os estudos com alelos mutantes letais determinamos a base genética usando um cromossomo balanceador fluorescente, por exemplo Kruppel-GFP 17. Analisamos a localização ferida repórter em diversas origens genéticas (Tabela 1). Uma possível modificação da técnica é combinar microinjeção e ferimento. Microinjecção pode ser utilizado para introduzir uma solução química para o embrião. Vários compostos químicos foram testados e verificou-se a regular a actividade dos repórteres epidérmico ferida 9. Este método de ferimento simultânea e microinjecção pode ser útil para aumentar o número de células no embrião de Drosophila que respondem um sinal ferida e pode ser usado directamente para controlar expressão de genes alterações após o ferimento 18. A futura aplicação da técnica de microinjeção será testar novas substâncias químicas para a regulação da resposta epidérmica ferida. Drosophila como sistema modelo para os estudos genéticos oferece uma ampla variedade de protocolos simples para tratar eficazmente questões complexas. As recentes notícias sobre a viabilidade das técnicas de Drosophila destaca o uso de hemocyte migração 19 e infecção parasitária vespa 20 como uma forma de ampliar ainda mais o impacto da comunidade de pesquisa Drosophila. Em adição aos estudos de reparação de feridas, Drosophila fornece um modelo clássico para a regeneração com o sistema de disco imaginal 21,22. Os avanços combinados em estudos de regeneração de discos imaginais e punção / microinjeção ferimento oferece um excelente sistema para descobrir componentes bem conservadas da reparação tecidual.

A manipulação de embriões de Drosophila, utilizando uma técnica de microinjecção é um ensaio bem estabelecido 1. O significado do método epidérmico ferida resposta repórter é combinar o protocolo para a punção / microinjecção com repórteres fluorescentes e visualizar a resposta in vivo a lesão epidérmica em embriões de Drosophila. O objetivo deste método é permitir que um conjunto mais amplo de cientistas usem Drosophila como uma ferramenta para investigar os processos que regulam a resposta transcricional a lesão punção epidérmica. A epiderme de camada única em Drosophila fornece um sistema simples para estudar uma resposta epidérmica ferida após uma lesão punção 2. O embrião de Drosophila é um sistema modelo robusto para dissecar geneticamente as fases de cicatrização de feridas, incluindo a resposta de feridas, inflamação e reepitelização 3. Isto é em parte porque muitos ou a maioria zigóticos mutantes sobreviver ao fim de embryogenesé e desenvolver barreiras epidérmicas mesmo quando padrões de desenvolvimento vai profundamente errado. Caracterização anterior de um factor de transcrição cabeça Granulado bem conservada (Grh), identificou-se que os genes-alvo Grh Dopa descarboxilase (DDC) e hidroxilase de tirosina (PLE) são transcricionalmente activados em torno dos locais de lesão 4. Drosophila como organismo modelo para a resposta de ferida fornece uma linha complementar de investigação para avançar os estudos em mamíferos cicatrização de feridas 5. Estudos subsequentes identificados genes adicionais induzidas por ferida de Drosophila e desenvolveu um &quot;kit&quot; de muitas feridas repórteres fluorescentes para monitorizar a resposta in vivo epidérmico ferida para limpar ferindo 6. As recentes notícias sobre a regulação da cicatrização de feridas Drosophila têm-se centrado no fenótipo fechamento da ferida, permitindo a descoberta de muitas vias que regulam a migração de células 7,8. Com a análise darepórteres fluorescentes ferida, os nossos estudos têm identificado um novo conjunto de genes necessários para a expressão de genes localizados ferida induzível epidérmicas 9. Um dos méritos do método repórter resposta ferida é que os resultados fornecer mais detalhes sobre um mecanismo de como os sinais são transduzidas do local da lesão às células vizinhas. No entanto, um dos pontos negativos do método repórter resposta ferida é que os resultados não ligar diretamente para fenótipos na cicatrização de feridas ou reparo. Uso mais amplo do protocolo punção ferida limpa em telas genéticos e químicos permitirá novos reguladores da resposta transcricional a epidérmicas ferindo ser identificados e promover a tradução de cicatrização de feridas descobertas em modelos de mamíferos de tratamentos de lesões.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

O embrião de Drosophila desenvolve uma camada epidérmica robusto que serve tanto para proteger as células internas a partir de um ambiente externo dura, bem como para manter a homeostase celular. Ferimento de punção com agulhas de vidro proporciona um método directo para desencadear uma resposta rápida de feridas epidérmicas que activa ferida repórteres de transcrição, que podem ser visualizadas através de um sinal repórter localizada em embriões vivos ou larvas. Punção ou laser lesão também fornece sinais que promovem o recrutamento de hemócitos no local da ferida. Surpreendentemente, grave (através de e) ferimento de punção em embriões de fase tardia apenas raramente perturba o desenvolvimento embrionário normal, tal como mais de 90% dos embriões feridos sobreviver à idade adulta, quando são injectados em embriões com um meio oleoso, que minimiza a fuga de imediato de hemolinfa de locais de punção . O procedimento ferida requer micromanipulação de embriões de Drosophila, incluindo alinhamento manual dos embriões em agplacas ar e transferência dos embriões alinhados à Microscopia. O ensaio de resposta epidérmica ferida Drosophila proporciona um sistema rápido para testar os requisitos genéticos de uma variedade de funções biológicas que promovem a cicatrização de feridas, bem como um modo para o rastreio de potenciais compostos químicos que promovem a cicatrização de feridas. O ciclo de vida curto e rotina de cultivo fácil fazer Drosophila um poderoso organismo modelo. Drosophila cura ferida limpa aparece para coordenar a resposta regenerativa da epiderme, com a resposta imune inata, de maneiras que ainda estão sob investigação, o que proporciona um excelente sistema para encontrar conservada regulamentar mecanismos comuns de Drosophila e de mamíferos ferida epidérmica.

Para obter os resultados apresentados no presente método, o quadro de leitura aberta da proteína fluorescente verde (GFP) é fundido a uma / sequência potenciadora induzida pela ferida promotor da dopa descarboxilase (DDC) e DsRed é fundida a uma sequência de ferida potenciador da tirosina hidroxilase ( plo) 4,6. Em um embrião de Drosophila vivo, a maturação da proteína fluorescente repórter ferida é optimizada de 4-6 horas após o ferimento, o qual permite que o tempo para a acumulação de proteína suficiente para visualizar, bem como o tempo para a proteína fluorescente para oxidar no estado fluorescente 15. Para observar a localização repórter, um microscópio de fluorescência composto é suficiente. Para observar um aumento mais elevado da localização repórter, um microscópio confocal é óptima para gerar uma projecção máxima de múltiplas secções ópticas (Figura 1). Confocal imagiologia in vivo de embriões de Drosophila é complicado pela raondulações pid do embrião. . A visão completa do embrião pode ser obtida com 20X objetivo e uma visão mais próxima do local de ferida pode ser obtida com 40X objetiva. A-vista superior da epiderme ferida repórter de localização pode ser trabalhada com 10 sucessivos cortes ópticos 1 Hm. A visão lateral epidérmica ferida repórter de localização pode ser trabalhada com 40 sucessivas 1 mícron secções ópticas. Usando métodos padrão de cruzamento genético, é possível combinar os repórteres ferida com mutações genéticas. Um exemplo apresentado neste artigo é Flotillin-2 (Flo-2), ganho de função (superexpressão gerado com expressão ubíqua em todas as células) porque mutantes de perda de função (alelo nulo gerado com P-elemento de inserção) e de Flo-2 demonstram o produto do gene Flo-2 é necessária e suficiente para inibir a localização do Ddc-GFP ferida repórteres 9 (Figuras 2A e 2B). Usando a microinjection protocolo, é possível testar se a introdução das soluções químicas superactivates ou inibe a localização dos repórteres da ferida. Embriões quimicamente feridas foram feridos e simultaneamente injectados com uma proporção de 1% de corante azul de toluidina e compostos solubilizados 01:04. Corante azul de toluidina permitiu a confirmação visual de compostos solubilizados sendo injetados na cavidade do corpo. Embriões controle foram feridos com uma agulha quebrada contendo 01:04 proporção de 1% corante azul de toluidina e soluto, sem química. Dois exemplos apresentados no presente documento são o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) e metil-β-ciclodextrina (MβCD), porque ambas as soluções químicas são suficientes para activar globalmente a localização do Ddc-GFP ferida repórteres 9 (Figuras 2C e 2D) . O peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) foi diluído em H2O para 0,6 M. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) foi solubilizada em 1 mM de NaOH a 3 mM. Usando o protocolo de fixação de embriões, é possível detectar a activação de transcrição de genes de resposta de ferida em um domínio localizado, em torno de um local de ferida. Um exemplo apresentado neste artigo é a hibridização in situ de sondas de RNA para detectar Ddc e transcrições soas 4,6,9 (Figuras 3A e 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. DDC-GFP e ple-DsRed ferida repórter localização. Brightfield e imagens fluorescentes em embriões de tipo selvagem feridos. (A) com melhor vista da DDC-GFP repórter feridas. (B) com melhor vista da ple-DsRed ferida repórter. Todas as imagens foram coletadas em uma Leica SP2 microscópio confocal, com 20X objetiva. Setas marcar local da ferida. As linhas tracejadas no painel de dadoss marcar os contornos de embriões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Localização do repórter Ddc-GFP feridas em fundos mutantes genéticos e químicos microinjeção de embriões. Claro e imagens fluorescentes de feridos Flotillin-2 (Flo-2) embriões mutantes. (A) perda de função Flo-2 {} KG00210 mutantes, expansão de actividade repórter em todas as células da epiderme. (B) Ganho de função Flo-2 (tatu-GAL4 UAS-Flo2) mutantes, a inibição da actividade repórter em todas as células da epiderme (C) peróxido. de hidrogénio (H 2 O 2 ) microinjeção solução, a expansão da reporter actividade ao longo de todas as células da epiderme. (D) Metil-β-ciclodextrina (MβCD) microinjecção solução, a expansão da actividade repórter em todas as células da epiderme. Todas as imagens foram coletadas em uma Leica SP2 microscópio confocal, com 20X objetiva. Setas marcar local da ferida. As linhas tracejadas nos painéis de dados marcar os contornos de embriões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Detecção de resposta ferida transcritos de RNA de genes. Imagens fluorescentes de hibridação in situ e detecção de ARN em embriões de tipo selvagem feridos. Ddc (A) e PLE (B) transcritos de ARN se acumulam em torno do local da ferida. Todas as imagens foram coletated em um microscópio Leica SP2 confocal, com objetivo de 20X. Setas marcar local da ferida. As linhas tracejadas nos painéis de dados marcar os contornos de embriões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Tabela 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabela 1. Resumo de repórteres resposta epidérmica ferida. Inserções dos quatro repórteres resposta ferida (DDC, ple, msn, KKV) estão disponíveis em ambos os segundo e terceiro cromossomos. Todos os repórteres de resposta ferida ativar o gene fluorescente (GFP ou DsRed) num número limitado de células epidérmicas que rodeiam o local do ferimento de punção no fundo de tipo selvagem (por exemplo, o fenótipo &quot;local&quot;). Ddc e msn ferida repórteres de resposta para exigir Grh ativação do fluorescengene ce após a lesão punção (por exemplo, &quot;none&quot; fenótipo). Todos os repórteres de feridas requerem Flo-2 para a localização do gene de fluorescência após a lesão punção (por exemplo, o fenótipo &quot;global&quot;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

A epiderme embrionárias de fase muito tardia embriões de Drosophila fornece um sistema in vivo para análise da resposta punção ferida rápido e pode ser combinado com manipulações genéticas ou tratamentos químicos microinjeção para avançar os estudos na cicatrização de feridas para a tradução em modelos de mamíferos.

Microinjeção Ferida Ensaio e<em&gt; In vivo</em&gt; Localização de Epidermal Wound resposta Jornalistas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.3K visualizações.  The City College of New York.  A epiderme embrionárias de fase muito tardia embriões de Drosophila fornece um sistema in vivo para análise da resposta punção ferida rápido e pode ser combinado com manipulações genéticas ou tratamentos químicos microinjeção para avançar os estudos na cicatrização de feridas para a tradução em modelos de mamíferos. 

Vídeo: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Bioengenharia

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

Entrega de genes e Transfection em células pancreáticas humanas Cancer usando Fator de Crescimento Epidérmico Receptor-alvo à base de gelatina Nanovectors Engineered

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificação da função global diastólica por análise baseada em Modelagem cinemática de transmitral fluxo através do formalismo de enchimento parametrizada diastólica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

Fabricação e caracterização de um Sistema Eletrônico Conformal-pele como para a gestão quantitativa, Ferida Cutânea

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...