Agradecemos a Valentina Greco pelos ratos K14-mCherry-H2B. Somos gratos à Oficina de Máquinas do Departamento de Física da Universidade de Emory por gerar os discos de vidro de cobertura. Este trabalho foi financiado pelo Career Development Award #IK2 BX005370 do US Department of Veterans Affairs BLRD Service para LS, NIH Awards RF1-AG079269 e R56-AG072473 para MJMR, e I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award para MJMR.

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes de cuidados e uso de animais da Emory University e Atlanta Veterans Affairs Medical Center e foi aprovada pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Instalação da inserção de imagem ao vivo no estágio do microscópio invertido
<ol><li>Construa a inserção usando arquivos .stl (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3) especificando as dimensões e o design 3D (consulte a Figura 1 e a Figura 2A), uma impressora 3D e ácido polilático (PLA).</li>
	<li>Coloque cuidadosamente a pastilha (Figura 2B,C) no sulco do estágio do microscópio grande (Figura 2C e Figura 3A). Use parafusos para fixar a pastilha através de quatro orifícios de parafusos localizados em cada canto da pastilha (Figura 2B-C). NOTA: A inserção é bidirecional e pode ser girada 180° dependendo da orientação do estágio do microscópio e do aparelho de anestesia.</li>
	<li>Deslize a placa de calor para o plugue de inserção de lado para baixo (Figura 2D) de modo que a unidade fique sobre os sulcos de inserção inferiores com a porta do plugue passando por baixo do estágio (Figura 3B).</li>
	<li>Alinhe a abertura circular ranhurada na pastilha com uma objetiva de imersão em óleo de silicone 40x (Figura 3C) e aplique óleo de silicone no centro da objetiva.<ol><li>Se a imagem for feita por períodos de tempo mais longos (>1 h), aplique um generoso pedaço de óleo que persistirá na interface coverslip/objetiva durante toda a imagem. Não permita que o óleo se derrame sobre as bordas da lente.</li>
	</ol></li>
	<li>Use uma seringa para aplicar uma pequena quantidade de graxa a vácuo ao longo da abertura circular ranhurada e coloque o disco deslizante sobre a tampa para selar a pastilha (Figura 3D). NOTA: O disco de deslizamento de cobertura é criado removendo as paredes de uma placa de cultura de células com fundo de vidro de 35 mm x 10 mm (realizada por uma oficina mecânica).</li>
	<li>Levante a objetiva de 40x até que o óleo beije o fundo da tampa de vidro.</li>
</ol>2. Configuração do isoflurano e preparação do mouse
<ol><li>Posicione os componentes do vaporizador eletrônico de baixo fluxo (câmara de anestesia, tubulação, vaporizador, vasilhame de carvão) para permitir que o cone nasal e a tubulação acoplada alcancem a inserção (Figura 3A). CUIDADO: O isoflurano é um anestésico inalatório e deve ser manuseado com cuidado para evitar derramamentos e minimizar a exposição humana.</li>
	<li>Medir o peso do frasco de isoflurano antes da utilização e registar. Fixe a tampa do vaporizador eletrônico ao frasco de isoflurano.</li>
	<li>Conecte o cabo de alimentação ao vaporizador eletrônico. Feche os clipes do cone do nariz azul e abra os clipes brancos da câmara de indução para permitir o fluxo de ar através da câmara para o recipiente de carvão. Remova a tampa de ar ambiente vermelha do lado esquerdo da máquina para permitir o fluxo de ar.</li>
	<li>Deixar o sistema aquecer por 5 min a 200 mL/min (fluxo baixo) e isoflurano a 2%. NOTA: Embora a configuração do cone do nariz esteja selecionada, a linha do cone do nariz azul deve permanecer fechada e a linha da câmara de indução branca deve permanecer aberta.</li>
	<li>Uma vez que o sistema esteja devidamente equilibrado, purge as linhas para remover o isoflurano restante da câmara.</li>
	<li>Coloque o mouse na câmara de indução e selecione Alto fluxo. Complete toda a preparação do rato (ou seja, depilação, entrega tópica de drogas, aplicação de pomada ocular, etc.) antes de colocar o corpo do animal sobre a inserção. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado usando o método do reflexo de pinça dos dedos.<ol><li>Com a perna estendida, use uma unha para apertar firmemente o dedo do pé sem causar danos físicos. Se o camundongo apresentar uma reação positiva ao estímulo (i.e., retração da perna, contração do pé, etc.), continue administrando anestésico dentro da câmara até que nenhuma reação seja observada. Uma vez adequadamente anestesiado, a frequência respiratória do camundongo deve diminuir para ~55-65 respirações por minuto18.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando o mouse estiver totalmente anestesiado, selecione Alto fluxo novamente para interromper a administração de isoflurano. Limpe a câmara antes de abrir e ajuste os clipes (azul: aberto; branco: fechado) para entregar isoflurano através do cone nasal. Selecione Baixo fluxo enquanto o cone do nariz está conectado ao mouse para continuar a administração de isoflurano.</li>
	<li>Tubo de rosca de isoflurano com o cone nasal acoplado através do suporte de tubo de canto no inserto (Figura 3A e Figura 5).</li>
</ol>3. Posicionamento do mouse na inserção para aquisição de imagens intravitais
<ol><li>Conecte a placa de calor ao controlador (contendo uma sonda anal conectada), ligue e deixe a placa atingir 36 °C (Figura 4A).</li>
	<li>Remova o camundongo anestesiado da câmara de indução e coloque-o sobre a placa de calor (Figura 4B e Figura 5A). Realize a transferência da câmara para inserir rapidamente para minimizar o tempo em que o mouse fica ativo sem anestesia inalante.</li>
	<li>Fixe o cone nasal no mouse (Figura 4B,C e Figura 5). Se necessário, use fita adesiva para fixar ainda mais o ângulo e o posicionamento do cone nasal.</li>
	<li>Insira a sonda anal e ajuste a temperatura do controlador até que a temperatura do corpo do mouse esteja estável em ~36 °C (Figura 4A,B). Depois que o mouse estiver posicionado corretamente, use filme plástico aderente para reter o calor, se necessário, para suportar ainda mais a temperatura corporal apropriada (Figura 4C).</li>
	<li>Posicione o mouse de forma que a cabeça fique alinhada com o disco deslizante e imobilize a orelha no centro da lamínula de vidro usando um clipe auricular de metal (Figura 5A,B) ou fita adesiva (Figura 5C). NOTA: A pressão do clipe auricular de metal na orelha pode ser ajustada soltando o parafuso que prende o clipe à inserção. Uma mola de metal pode ser adicionada para maior flexibilidade de aperto do grampo.<ol><li>Para alterar a localização do clipe auricular, desaparafuse o parafuso com uma chave Allen de 2,5 mm e transfira para o local secundário (Figura 2B,C). Ao remontar o clipe auricular, coloque-o contra a pastilha, seguido da arruela por cima. Use um parafuso para prender o clipe com segurança com leve força para girar o clipe.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajustar o posicionamento z da objetiva até que as células estejam dentro do ponto focal (Figura 6A,D). Defina os parâmetros z-stack e time-lapse de acordo com os objetivos experimentais e inicie a aquisição da imagem. NOTA: Se a configuração correta for obtida, a orelha do mouse pode ser fotografada por pelo menos 3 h consecutivas (Figura 6A',D').<ol><li>Uma vez que os limites da pilha z estejam definidos, ajuste a potência e o ganho do laser para garantir que nenhum plano z esteja saturado demais para minimizar o fotoclareamento. Determine os parâmetros de lapso de tempo usando a espessura total da pilha z, números de passo (amostragem de Nyquist recomendada) e intervalos de tempo.</li>
		<li>Determine os parâmetros de imagem (intervalos de tempo, tempo total de imagem, etc.) usando múltiplos fatores, incluindo viabilidade animal sob anestesia, fotoclareamento/fototoxicidade induzida por laser e o objetivo de imagens ao vivo (ou seja, dinâmica de divisão celular, interações célula-célula, etc.).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Término da imagem
<ol><li>Ligue a almofada térmica circulante de água e ajuste para Ciclo Contínuo e 35 °C por pelo menos 30 minutos antes do término da aquisição da imagem.</li>
	<li>Após a conclusão da imagem, selecione Baixo fluxo no vaporizador eletrônico para interromper a administração de isoflurano e mova o mouse para uma almofada térmica até o deambulação.</li>
	<li>Uma vez acordado, mova o mouse de volta para o recipiente de transferência enquanto continua a manter em uma almofada térmica até que seja totalmente deambulado. Monitore consistentemente o mouse enquanto estiver na almofada térmica até que ele responda.</li>
	<li>No vaporizador eletrônico, clique em Selecionar menu > Controle anestésico > Vazio. Retire o frasco de isoflurano do sistema e coloque a tampa do fabricante de volta no frasco.</li>
	<li>Meça o peso do frasco de isoflurano e do botijão de carvão e insira os pesos no log. Uma vez que o botijão de carvão pese 50 g sobre a medição inicial, elimine o botijão e substitua-o por uma nova unidade. Devolva o isoflurano ao cofre.</li>
	<li>Remova o disco de deslizamento da tampa e limpe com papel de lente e solução de lente. Armazenar corretamente para evitar riscos para reutilização.</li>
	<li>Remova a tubulação de anestesia do suporte de inserção e desaparafuse a inserção do estágio do microscópio.</li>
</ol>

Imagens intravitais usando um microscópio invertido para rastrear a dinâmica das células da pele

<ol>
	<li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment.">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li><li>Nal Chen, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy.">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196 (2022).</li><li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver.">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li><li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+imaging+of+breast+cancer.">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li><li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration.">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse.">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li><li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis.">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li><li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin.">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li><li>Pal Arndt, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra/extraglomerular+feedback+system.">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).</li><li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy.">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li><li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice.">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li><li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues.">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).</li><li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology.">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li><li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue.">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).</li><li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool.">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li><li>Ral Li, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response.">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Tal Tumbar, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Neste estudo, apresentamos uma nova ferramenta que facilita imagens intravitais estáveis e de longo prazo de epitélios intactos da pele de camundongos em microscópios confocais invertidos. Esta invenção é feita de PLA, que é o material mais comum e barato imprimível em 3D; todos os custos internos de impressão 3D para esta inserção totalizam < $5. As duas peças de inserção separadas (Figura 1, Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2) pode...

A microscopia intravital é uma poderosa ferramenta que permite o monitoramento do comportamento celular em seus ambientes in vivo não perturbados. Este método único forneceu informações importantes sobre o funcionamento interno de sistemas orgânicos complexos de mamíferos, incluindo o pulmão1, cérebro2, fígado3, glândula mamária4, intestino5 e pele6. Além disso, essa abordagem tem revelado alterações comportamentais celulares durante o desenvolvimentotumoral7, cicatrização deferidas8,9, inflamação10 e outras diversas patologias in situ. Neste estudo, nos concentramos em melhorar a acessibilidade da microscopia intravital para obter imagens da dinâmica epitelial e estromal viva em pele intacta de camundongos. A compreensão do comportamento celular na pele de mamíferos é de grande importância clínica devido à notável capacidade regenerativa e tumorigênica deste tecido.
A imagem intravital em camundongos tem sido realizada principalmente usando microscópios multifótons verticais devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução em profundidades teciduais >100 μm11,12. No entanto, esses instrumentos carecem da versatilidade e acessibilidade mais geral dos microscópios confocais invertidos, que são mais fáceis de usar e econômicos, fornecem a capacidade de obter imagens de células cultivadas, não requerem escuridão completa durante a aquisição das imagens e geralmente são mais seguros, entre outras vantagens notáveis13,14. Neste trabalho, apresentamos uma nova ferramenta que melhora significativamente a acessibilidade de imagens intravitais, adaptando essa abordagem para microscópios confocais invertidos.
Aqui, apresentamos um design de inserção de estágio personalizado impresso em 3D que incorpora várias características importantes para facilitar imagens intravitais estáveis e de longo prazo da pele da orelha de camundongos em um microscópio confocal invertido (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Esses recursos especializados incluem um orifício objetivo deslocado que permite que o corpo inteiro de um mouse adulto fique totalmente plano durante a aquisição de imagens. Isso minimiza a interferência vibracional dos movimentos do corpo de camundongos nas imagens e elimina a necessidade de administrar cetamina e xilazina para atenuar a respiração, uma prática frequentemente associada a imagens intravitais6. Além disso, os suportes de canto na pastilha posicionam corretamente um cone nasal de isoflurano para se alinhar com a face do mouse, um clipe de orelha de metal imobiliza a orelha do mouse para um disco de deslizamento de capa personalizado e uma placa de calor de biofeedback de circuito fechado destacável opcional fica nivelada dentro da inserção para suportar a temperatura corporal do mouse durante longas sessões de imagem. O disco de deslizamento de capa personalizado, que fornece uma superfície plana essencial para a cabeça e a orelha do rato ficarem planas, foi gerado em uma oficina de máquinas removendo as paredes de um prato genérico de cultura celular contendo lamínula. O uso de uma lente de imersão em óleo de silicone de 40x (abertura numérica de 1,25 [N.A.], distância de trabalho de 0,3 mm) em conjunto com o disco de deslizamento de cobertura e inserção de estágio personalizada fornece imagens de alta resolução >50 μm de profundidade na derme da orelha.
Para testar a funcionalidade desta nova inserção de estágio de microscópio invertido, capturamos pilhas z abrangendo todas as camadas epiteliais epidérmicas ao longo de um curso de tempo de 3 h na orelha de um camundongo adulto vivo transgênico K14-H2B-mCherry15 (núcleos epiteliais nesta linhagem de camundongo contêm uma etiqueta fluorescente vermelha) (Figura 6A-A'). Também capturamos pilhas-z abrangendo várias camadas de fibroblastos dentro da derme da pele durante um curso de tempo de 3 h na orelha de um Pdgfra-rtTA transgênico vivo16; Camundongos adultos pTRE-H2B-GFP17 (núcleos de fibroblastos nesta linhagem de camundongos contêm um rótulo fluorescente verde após indução de doxiciclina) (Figura 6B-D'). Nossos dados de alta resolução demonstram estabilidade consistente pela falta de deriva nos planos x, y e z, comprovando a eficácia desta nova ferramenta de imagem intravital para uso em microscópios invertidos. É importante ressaltar que as dimensões dessa inserção de estágio impressa em 3D podem ser ajustadas, conforme descrito em Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2 e Arquivo Suplementar 3, para caber em qualquer microscópio invertido, e o posicionamento da abertura objetiva pode ser movido para locais alternativos dentro da pastilha para melhor se adequar à imagem de um determinado tecido e/ou modelo animal de interesse. Esta invenção pode, assim, capacitar laboratórios individuais, ou investigadores com acesso confocal de instalações centrais, para adaptar esta ferramenta para suas necessidades únicas de imagem intravital, simplificando assim a avaliação de biologia celular in vivo diversa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Qudi Tech</td>
			<td>i-Fast</td>
			<td>3D prints using PLA material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x 1.25NA silicone objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Swab</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76337-046</td>
			<td>Cream/ointment application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screwdriver (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Affiix insert to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screws x 4 (#6-32)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Screw insert into microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dish</td>
			<td>chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1811-002</td>
			<td>Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Plate controller</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td>Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (1.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For M3 setscrew adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust tension on metal ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging Insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>HPA030782-100uL</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape (or Scotch Tape)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-458</td>
			<td>Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal fastener</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used as ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:034459</td>
			<td>Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: K14-H2BPAmCherry</td>
			<td>Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University</td>
			<td></td>
			<td>Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as &#34;K14-H2B-mCherry&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK 
			Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:005104</td>
			<td>&#160;Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Sealing Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td>Enhance mouse warmth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MSPP-078932779</td>
			<td>Eye lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screws x 3 (M3; 6 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3M6</td>
			<td>Attachment for heatplate module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Immersion Oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Applied to 40x silicone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heating Plate</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td>Provides heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP1095</td>
			<td>Seals coverslip disk to insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hair removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulating heat pad</td>
			<td>Stryker Medical</td>
			<td>TP700</td>
			<td>for mouse revival post-imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined intravital imaging approach for long-term monitoring of epithelial tissue dynamics on an inverted confocal microscope

A compreensão do comportamento celular in vivo normal e aberrante é necessária para desenvolver intervenções clínicas que impeçam o início e a progressão da doença. Portanto, é fundamental otimizar as abordagens de imagem que facilitem a observação da dinâmica celular in situ, onde a estrutura e a composição do tecido permanecem inalteradas. A epiderme é a barreira mais externa do corpo, bem como a fonte dos cânceres humanos mais prevalentes, ou seja, os carcinomas cutâneos de pele. A acessibilidade do tecido cutâneo apresenta uma oportunidade única para monitorar o comportamento das células epiteliais e dérmicas em animais intactos usando microscopia intravital não invasiva. No entanto, essa abordagem sofisticada de imagem tem sido realizada principalmente usando microscópios multifótons verticais, que representam uma barreira significativa de entrada para a maioria dos investigadores. Este estudo apresenta um microscópio impresso em 3D com design personalizado, inserido em estágio de microscópio adequado para uso com microscópios confocais invertidos, simplificando a imagem intravital a longo prazo da pele da orelha em camundongos transgênicos vivos. Acreditamos que esta invenção versátil, que pode ser personalizada para se ajustar à marca e ao modelo de microscópio invertido de escolha e adaptada para sistemas de órgãos adicionais de imagem, será inestimável para a maior comunidade de pesquisa científica, melhorando significativamente a acessibilidade da microscopia intravital. Esse avanço tecnológico é fundamental para reforçar nossa compreensão da dinâmica de células vivas em contextos normais e de doenças.

Intravital microscopy is a powerful tool that allows the monitoring of cell behaviors in their unperturbed in vivo environments. This unique method has provided key insights into the inner workings of complex mammalian organ systems, including the lung1, brain2, liver3, mammary gland4, intestine5, and skin6. Furthermore, this approach has revealed cell behavioral alterations during tumor development7, wound healing8,9, inflammation10, and other diverse pathologies in situ. In this study, we focus on enhancing the accessibility of intravital microscopy to image live epithelial and stromal dynamics in intact mouse skin. Understanding cell behaviors in mammalian skin is of high clinical importance due to the remarkable regenerative and tumorigenic capacity of this tissue.
Intravital imaging in mice has&#160;been primarily performed using upright multiphoton microscopes due to their ability to provide high-resolution imaging at tissue depths &#62;100 &#181;m11,12. Nevertheless, these instruments&#160;lack the workhorse versatility and more general accessibility of inverted confocal microscopes, which are more user-friendly and cost-effective, provide the ability to image cultured cells, do not require complete darkness during image acquisition, and are generally safer, among other notable advantages13,14. In this study, we present a new tool that significantly enhances intravital imaging accessibility by adapting this approach for inverted confocal microscopes.
Here, we present a 3D-printed custom stage insert design that incorporates several key features to facilitate stable, long-term intravital imaging of mouse ear skin on an inverted confocal microscope (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, and Figure 5). These specialized features include an offset objective hole that allows the full body of an adult mouse to lay entirely flat during imaging. This minimizes the vibrational interference of mouse body movements on imaging and eliminates the need to administer ketamine and xylazine to dampen breathing, a practice often coupled with intravital imaging6. In addition, corner brackets on the insert correctly position an isoflurane nose cone to align with the face of the mouse, a metal ear clip immobilizes the mouse ear to a custom-built coverslip disk, and an optional detachable closed-loop biofeedback heat plate lies flush within the insert to support the mouse body temperature during long imaging sessions. The custom coverslip disk, which provides a flat surface essential for the mouse head and ear to lay flat, was generated in a machine shop by removing the walls of a generic coverslip-containing cell culture dish. The use of a 40x silicone oil immersion lens (1.25 numerical aperture [N.A.], 0.3 mm working distance) in conjunction with the coverslip disk and custom stage insert provides high resolution images &#62;50 &#181;m deep into the ear dermis.
To test the functionality of this new inverted microscope stage insert, we captured z-stacks spanning all epidermal epithelial layers over a 3 h time course in the ear of a live transgenic K14-H2B-mCherry15 adult mouse (epithelial nuclei in this mouse line contain a red fluorescent label) (Figure 6A-A&#39;). We also captured z-stacks spanning several fibroblast layers within the skin dermis over a 3 h time course in the ear of a live transgenic Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adult mouse (fibroblast nuclei in this mouse line contain a green fluorescent label following doxycycline induction) (Figure 6B-D&#39;). Our high-resolution data demonstrate consistent stability by lack of drift in the x-, y-, and z-planes, thus proving the effectiveness of this new intravital imaging tool for use on inverted microscopes. Importantly, the dimensions of this 3D-printed stage insert can be adjusted, as described in Supplementary File 1, Supplementary File 2, and Supplementary File&#160;3, to fit any inverted microscope, and the positioning of the objective opening can be moved to alternative locations within the insert to better suit imaging a particular tissue and/or animal model of interest. This invention can thus empower individual laboratories, or investigators with core facility confocal access, to adapt this tool for their unique intravital imaging needs, thereby streamlining evaluation of diverse in vivo cell biology.

Autor em destaque: Desenvolvendo uma ferramenta para o uso de microscópios confocais invertidos para imagens intravitais in vivo 

Abordagem simplificada de imagem intravital para monitoramento de longo prazo da dinâmica do tecido epitelial em um microscópio confocal invertido

We developed a tool to perform intravital imaging on live mice using an inverted confocal microscope. This enables us to track skin cell dynamics throughout homeostasis and compare cell behaviors during disease onset and progression. Multiphoton microscopy is the primary approach applied to achieve intravital cell tracking.However, the disadvantages of these microscopes include limited day-to-day imaging versatility, high cost, and technical complexity. Our new tool enables the use of versatile inverted confocal microscopes for in vivo intravital imaging. By modifying the design file, the stage insert dimensions can be customized to fit any make of inverted microscope.The objective hole can be resized and repositioned to fit any animal model and tissue of choice.

A montagem adequada da inserção de imagem ao vivo em um microscópio confocal invertido e a orientação apropriada de um camundongo transgênico sobre a inserção são validadas pela aquisição de pilhas z de tecido auditivo vivo marcado fluorescentemente ao longo de um curso de tempo ≥1 h com evidência mínima de deriva nos eixos x, y e z. As imagens devem ser capturadas em intervalos consistentes (o tempo de intervalo dependerá da questão biológica, da força do sinal de fluorescência, etc.) para que a din?...

Watch this Scientific Journal Video about Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging at JoVE.com

O protocolo apresenta uma nova ferramenta para simplificar a obtenção de imagens intravitais usando microscopia confocal invertida.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Desenvolvemos uma ferramenta para realizar imagens intravitais em camundongos vivos usando um microscópio confocal invertido. Isso nos permite acompanhar a dinâmica celular da pele ao longo da homeostase e comparar o comportamento celular durante o início e a progressão da doença. A microscopia multifóton é a principal abordagem aplicada para obter o rastreamento celular intravital.No entanto, as desvantagens desses microscópios incluem versatilidade de imagem diária limitada, alto custo e complexidade técnica. Nossa nova ferramenta permite o uso de versáteis microscópios confocais invertidos para imagens intravitais in vivo. Ao modificar o arquivo de projeto, as dimensões da inserção do estágio podem ser personalizadas para se ajustar a qualquer marca de microscópio invertido.O orifício objetivo pode ser redimensionado e reposicionado para se ajustar a qualquer modelo animal e tecido de escolha.

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Research

JoVE Journal

Biology

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

1.1K visualizações.  Emory University School of Medicine. Desenvolvemos uma ferramenta para realizar imagens intravitais em camundongos vivos usando um microscópio confocal invertido. Isso nos permite acompanhar a dinâmica celular da pele ao longo da homeostase e comparar o comportamento celular durante o início e a progressão da doença. A microscopia multifóton é a principal abordagem aplicada para obter o rastreamento celular intravital.No entanto, as desvantagens desses microscópios incluem versatilidade de imagem diária limitada,...

Vídeo: Autor em destaque: Desenvolvendo uma ferramenta para o uso de microscópios confocais invertidos para imagens intravitais in vivo 

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It is therefore critical to optimize imaging approaches that facilitate the observation of cell dynamics in situ, where tissue structure and composition remain unperturbed. The epidermis is the body&#39;s outermost barrier, as well as the source of the most prevalent human cancers, namely cutaneous skin carcinomas. The accessibility of skin tissue presents a unique opportunity to monitor epithelial and dermal cell behaviors in intact animals using noninvasive intravital microscopy. Nevertheless, this sophisticated imaging approach has primarily been achieved using upright multiphoton microscopes, which represent a significant barrier for entry for most investigators. This study presents a custom-designed, 3D-printed microscope stage insert suitable for use with inverted confocal microscopes, streamlining the long-term intravital imaging of ear skin in live transgenic mice. We believe this versatile invention, which may be customized to fit the inverted microscope brand and model of choice and adapted to image additional organ systems, will prove invaluable to the greater scientific research community by significantly enhancing the accessibility of intravital microscopy. This technological advancement is critical for bolstering our understanding of live cell dynamics in normal and disease contexts.

The protocol presents a new tool to simplify intravital imaging using inverted confocal microscopy.

Biologia

Installing the Live Imaging Insert on an Inverted Microscope Stage

To begin installing the 3D printed live imaging insert on the inverted microscope stage, carefully place the insert into the large microscope stage groove. Using screws, secure each corner of the insert. Slide the heat plate into the side opening of the insert in a plug side down orientation, so the plate lays atop the lower insert grooves with the plug port underneath the stage.Align the grooved circular opening in the insert with a 40 x silicone oil immersion objective and apply silicone oil to the center of the objective. Then using a syringe, apply a small amount of vacuum grease along the grooved circular opening. Lay the cover slip disk on top of the opening to seal it onto the insert.Finally, raise the 40 x objective until it barely touches the bottom of the glass cover slip.

Instalando o Live Imaging Insert em um estágio de microscópio invertido

Mounting the Mouse on the Live Imaging Insert for Intravital Imaging

Before placing the anesthetized mouse on the live imaging insert installed on the inverted microscope stage, thread the isoflurane tubing with the attached nose cone through the corner tubing bracket on the insert. After plugging the heat plate into the controller containing an attached anal thermometer probe and switching it on, transfer the anesthetized mouse from the induction chamber onto the heat plate. Then secure the nose cone onto the mouse.Insert the anal probe into the animal and adjust the controller to maintain a stable body temperature of about 36 degrees Celsius. Cover the properly-positioned mouse with a plastic cling wrap to trap body heat and elevate the body temperature. Position the mouse such that its head aligns with the cover slip disc and immobilize its ear onto the center of the glass cover slip using a metal ear clip or tape.After completing imaging, select the Low Flow option on the electronic vaporizer to cease isoflurane delivery. Transfer the mouse to a heating pad until it becomes ambulatory. After removing the cover slip disc, wipe it clean with lens paper and lens solution.Store it properly to avoid scratches for reuse. Next, detach the anesthetic tubing from the insert bracket and unscrew the insert from the microscope stage. The acquired Z-stacks of fluorescently-labeled live mouse ear tissue showed minimal drift in the x, y and z axes over time, validating the custom 3D printed live imaging inserts.The time points from a three hour time lapse movie of the mCherry positive mouse ear epidermal cells of an adult male mouse revealed a single z plane remaining in focus over the extended time. Similar observations were made from another three-hour time lapse movie of GFP positive ear dermal fibroblasts of an adult female mouse.