O transplante de timo é um método importante para investigar a função das células epiteliais de timo e a maturação de células T in vivo. Este protocolo simples e eficiente pode ser usado para isolar e cultivar o camundongo 18.5 timo para posterior transplante em uma cápsula renal. O protocolo para o transplante de timo 18,5 pode ser modificado para transplante timiático em outros estágios de desenvolvimento ou para outros tecidos de tamanho semelhante.
Além disso, este procedimento é muito simples. Os detalhes de alguns dos carimbos do caso devem ser revisados cuidadosamente ao executar esta técnica pela primeira vez. Este procedimento contém manipulações detalhadas que podem ser melhor ilustradas com visualização.
Após o sacrifício, limpe o camundongo embrionário 18,5 gestante com 70% de etanol e use instrumentos esterilizados autoclavados para fazer um corte em forma de V no abdômen da bexiga até cada chifre do útero. Use uma tesoura para cortar o mesometrium e áreas cervicais e vaginais e colher o útero em uma placa de Petri contendo PBS frio no gelo. Corte a parede uterina anterior de um chifre uterino para o outro para expor os embriões dentro do envelopio para decidir e usar pinças finas para descascar os tecidos decisivos.
Corte o cordão umbilical para liberar os embriões para transferência em uma nova placa de Petri no gelo. Para colher o primeiro timo, limpe um embrião com 70% de álcool e transfira o embrião para uma nova placa de Petri. Após a decapitação, fixar o embrião no prato na posição supina e usar uma tesoura estéril para cortar a parede lateral do peito horizontalmente ao longo da frente axilar.
Corte o diafragma para abrir o peito. O timo deve ser visível como dois lóbulos brancos localizados em frente à traqueia e adjacentes ao coração. Insira cuidadosamente fórceps de ponta dobradas atrás do timo e puxe suavemente para cima para colher o tecido.
Verifique a integridade do timo para confirmar que ele contém dois lóbulos articulados. Em seguida, lave o timo com PBS antes de usar um microscópio estéreo para cortar os tecidos conjuntivos e vasos sanguíneos. Quando todos os timmis tiverem sido coletados, transfira cada tecido limpo para poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 500 microliters de cultura média por poço.
E adicione 2'deoxygranosine a uma concentração final de 1,25 mililitro por poço. Em seguida, coloque a timmi isolada na incubadora de cultura celular por oito dias. No último dia de cultura, use uma tesoura para cortar uma agulha de veia do couro cabeludo na parte do tubo de infusão em um ângulo de 45 graus e confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do pé em um animal receptor nu.
Coloque o mouse sobre a mesa de operação em uma posição lateral direita e use um cotonete de iodo de 0,5% povidone para cotonhar a pele na área cirúrgica duas vezes de dentro para fora do corpo. Use o bisturi para fazer uma incisão de pele de cinco a nove milímetros paralela à coluna vertebral na área renal esquerda e corte através do tecido e músculo subcutâneo para abrir a cavidade abdominal. Usando um par de pinças com uma mão, levante o músculo e o tecido adiposo da borda da incisão do lado da coluna vertebral do rim exposto e use a outra mão para espremer suavemente o rim.
Para manter a cápsula renal úmida durante a cirurgia, molhe a superfície do rim com soro fisiológico e use a agulha do couro cabeludo para coçar suavemente a cápsula renal no lado inferior direito cerca de 1/2 a 2/3 da largura do rim. Deslize o tubo de infusão para o corte da cápsula e desprende suavemente a cápsula renal do rim longo o longo lado do rim cerca de três a quatro milímetros na cápsula renal. Em seguida, retraia o tubo de infusão.
Para implantar o timo no espaço subcapsular criado, lave um timo de cultura duas vezes em soro fisiológico fresco e conecte o tubo de infusão cortado a uma seringa. Aspire lentamente o timo preparado no tubo de infusão modificado. E insira suavemente o tubo de infusão na cápsula renal até chegar ao polo superior.
Para entregar o timo na cápsula renal, retraia o tubo lentamente enquanto simultaneamente deprimi o êmbolo. Usando uma lâmpada de álcool, aqueça levemente a agulha do couro cabeludo e depois de confirmar que todo o timo está dentro do espaço subcapsular, use a agulha aquecida para cauterizar o corte. Restaure o rim cauterizado na cavidade abdominal e feche o peritônio e o músculo com suturas.
Usando uma sutura de colchão vertical interrompida modificada, feche a incisão da pele com pelo menos três nós e use um cotonete de iodo povidone para desinfetar a incisão. Em seguida, forneça uma injeção subcutânea de antibiótico e analgesia e coloque o mouse sob uma lâmpada infravermelha com monitoramento até a recuperação completa. Aqui, pode-se observar um dia embrionário isolado 18,5 de timo contendo dois lobos completos.
Imediatamente após a implantação, o timo pode ser visualizado sob a cápsula renal na ponta do rim receptor. Após oito semanas de crescimento dentro do animal receptor de camundongos nus, o timo permanece sob a cápsula, mas aumenta robustamente em tamanho. As células T são produzidas tanto no timo transplantado quanto no sangue periférico dos receptores de camundongos nus.
Mas, como esperado, nenhuma célula T é detectada no periférico de animais nus não transplantados. Além disso, neste experimento representativo, nenhum gene LacZ foi detectado nas células T periféricas colhidas do sangue periférico de receptores de camundongos nus transplantados com lóbulos de timo contendo o alelo LacZ, indicando que células T periféricas foram geradas a partir dos animais receptores. Seja gentil ao deslizar o tubo em uma cápsula renal.
Evite quebrar a cápsula. E certifique-se de ter espaço suficiente para a entrega de timo. Populações de células T t t temicas ou periféricas podem ser analisadas usando citômetro de fluxo.
Onde, as respostas imunes nos tecidos periféricos do receptor podem ser analisadas pelo I2D e pela análise histoquímica imune.
