Este trabalho foi financiado pelo NIH HL108801 subsídios P01, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, a AMK Choi. S. Ryter recebeu apoio salário do Instituto de Pesquisa Respiratória Lovelace.

Nota: A Comissão Institucional Animal Care e Use a Brigham and Area Hospital / Harvard Medical School da Mulher aprovou os seguintes procedimentos. 1. Cecal ligadura e punção Use os ratos do mesmo fundo (C57Bl / 6), do sexo masculino, 8-10 semanas de idade. Camundongos fêmeas são mais resistentes do que os homens contra a letalidade induzida por sepse. Ratos com idade superior a 8 semanas produzir resultados menos variáveis ​​do que os ratos mais jovens, em termos de sobrevivência após CLP. Aproximadamente N = 10 ratos por grupo de comparação deve ser utilizado para a análise de sobrevivência. N = 3-5 ratinhos é adequado para ensaios autofagia. <ol><li> Use pequenos instrumentos cirúrgicos estéreis (ou seja, bisturi, tesouras e pinças anatômicas sem corte), que deve ser apropriado para a cirurgia de roedores. </li><li> Prepare a mistura de anestesia: A 7,95 ml de PBS, adicionar 150 mL de xilazina (AnaSed injecção de 100 mg / mL) e 700 mL de cetamina (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / mL). </li><li> Para garantir condições de assepsia durante o procedimento, use luvas, máscara e bata cirúrgica. </li><li> Pesar animais. Anestesiar los através da injecção intraperitoneal (ip), a mistura mencionada no passo 3, em uma dosagem de ul (10x o peso corporal em g). Por exemplo, para um rato pesando 22 g, administrar 10x22 = 220 ul da mistura de anestésico. Assim, as doses finais de xilazina e cetamina são 17 e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Certifique-se de que a anestesia é adequada, sem flexão da extremidade deve ser produzido após toe pitada Nota:. Use pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Coloque os animais em uma superfície de trabalho limpa em suas costas. Tails e patas traseiras são orientadas para o investigador. Desinfetar a pele abdominal com álcool (solução de EtOH 70%) Nota:. Área cirúrgica deve ser completamente raspada, para evitar a contaminação da ferida através do contato compele. Além disso, de forma ideal, uma almofada de água quente circulante devem ser utilizados para manutenção da temperatura dos ratos anestesiados durante a cirurgia. </li><li> Usando um bisturi, fazer uma pequena incisão na pele longitudinal paralelo e aproximadamente 1 cm para a esquerda para a linha média. Não penetram ainda para dentro da cavidade peritoneal. Use pequenas tesouras para alargar a incisão inicial. </li><li> Identificar os músculos abdominais e dissecá-los para ganhar acesso para a cavidade peritoneal. </li><li> Usando uma pinça anatômica sem corte, identifique o ceco e movê-lo para fora da cavidade peritoneal. Tenha cuidado para não danificar os vasos sanguíneos mesentéricos (isso pode levar a hemorragia letal). </li><li> Ligadura de 60% do ceco para atingir um grau médio sépsis. Ligando igual ou superior a 75% do ceco geralmente resulta em septicemia alto grau, enquanto que ligando igual ou inferior a 25% dos resultados do ceco em sépsis de baixo grau. Tenha cuidado para não ligadura a válvula ileocecal (o que poderia bloquear a continuidade intestinal). </li><li> Ao utilizar um21 G agulha, perfurar o ceco por um através-e-através de punção (dois furos) perto da ligadura. A direcção da perfuração deve ser da mesentérica para o lado anti-mesentérica do ceco. Tenha cuidado para não furar os vasos sanguíneos mesentéricos. </li><li> Retirar a agulha. Suavemente espremer o ceco ligado para confirmar a permeabilidade através dos dois orifícios, apenas uma pequena quantidade de fezes devem ser extrudido através deles. </li><li> Mover o ceco ligado e perfurado no interior da cavidade peritoneal. Nota: Para os ratos sham, pule as etapas de 1,10-1,12. </li><li> Use seda suturas cirúrgicas 6-0 com agulha cortante para fechar musculatura abdominal. Use seda suturas cirúrgicas 6-0 com agulha cortante para fechar a pele abdominal. </li><li> Injectar 1 mL de pré-aquecido (37 ° C) ip soro fisiológico normal para substituir o calor e hidratação perdida durante o processo. Coloque os ratos sob uma lâmpada de calor até a sua reanimação Nota:. Idealmente, um dispositivo de aquecimento mais seguro (such como uma rampa de água quente circulando) pode ser usado em vez de uma lâmpada de calor. </li><li> No pós-operatório injetar buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal sc.) Para alcançar analgesia Nota:. Um animal não deve ser deixado sozinho até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Um animal que tenha sido submetido a tratamento cirúrgico não deve ser devolvido para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li><li> Coloque os animais de volta em suas gaiolas com acesso ilimitado a comida e água. Ratos serão sacrificados quando se tornam moribundo (indicado por sinais clínicos como a incapacidade de se mover quando tocado ou cianose). Verifique camundongos cada 4 horas para evitar que eles morram antes da eutanásia. </li></ol> 2. Tissue Colheita e Fixação <ol><li> Prepara-se uma solução de 4% de paraformaldeído (PFA): Para 889 ml de PBS, adicionar 111 ml de 37% de PFA. </li><li> Sacrifício camundongos usando CO narcose induzida de 2 ou cetamina / xilazina slução numa dosagem elevada. </li><li> Imobilizar os ratos sobre uma superfície de trabalho limpa. Pulverizar a pele abdominal e torácica com solução EtOH 70% desinfectá-lo. </li><li> Usar um bisturi e pequenas tesouras para remover a pele abdominal e torácica, bem como a pele que cobre a área da traqueia. </li><li> Revelar traquéia, removendo seus tecidos circundantes (músculos e tecido conjuntivo). </li><li> Coloque uma sutura (sem agulha cortante) em torno da traquéia. Não aperte ainda. </li><li> Use um cateter venoso periférico pequeno (20 g) a traquéia &#39;entubar&#39;. Tenha cuidado durante a inserção do cateter para evitar desgaste traqueal. Note-se que o maior diâmetro da traquéia está logo abaixo da cartilagem cricóide. </li><li> Apertar a sutura em torno da traqueia / cateter. Remover a agulha, deixando apenas a cânula de plástico do cateter na traqueia. Agulha serviu apenas como um guia-fios para a inserção da cânula de plástico. </li><li> Depois de ter assegurado a cânula de plástico na traquéia, corte ºe musculatura abdominal, abrir o abdômen e revelar o diafragma. </li><li> Usando uma agulha, perfure o diafragma para a produção de pneumotórax (isto é, inserção de ar na cavidade pleural). Pulmões deve então ser recolhido. </li><li> Com uma tesoura pequena, retire o diafragma, corte ao longo do esterno (esternotomia), remova a caixa torácica e revelar o coração e os pulmões. </li><li> Através da cânula de plástico inserido na traqueia, corrigir os pulmões com uma solução de formaldeído a menos de 30 cm de H 2 O de pressão. </li><li> Retirar os pulmões e colocá-los no PFA a 4% durante 24 horas e subsequentemente em 70% de solução de EtOH até à transformação. </li><li> Identificar e remover coração, fígado e rins. Da mesma maneira, a colocá-los em PFA a 4% durante 24 horas e subsequentemente em 70% de solução de EtOH até à transformação. </li></ol> 3. Ratos GFP e visualização de GFP Slides <ol><li> Realize CLP e cirurgia fictícia em camundongos GFP-LC3 como descrito no passo 1, e procedimento pós-operatórios como descrito no passo 2 do protocolo. </li><li> Incorporar os tecidos (nomeadamente os pulmões, coração, fígado e rins) em parafina e corte-os em série 5 mm de. </li><li> Quando pronta para a coloração de GFP, incuba-se a 60 ° C durante 30-60 minutos até se derrete parafina e tecido parece translúcida. </li><li> Retire a parafina com série graduada padrão de xileno ou xileno substitutos, 5 min xileno 1, 2, xileno e xileno 3 então 3 min incubações em série graduada de EtOH: 100%, 95%, 75%, e depois enxaguar em água destilada. Nota: Após desparafinização evitar a dessecação do tecido, o que aumenta o fundo da amostra. </li><li> Executar a recuperação de antigénio utilizando um tampão de ácido cítrico (ácido 10 mM de citrato de sódio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), por microondas durante 10-20 min. Tenha cuidado para substituir tampão periodicamente para evitar a dessecação dos tecidos. </li><li> Deixa-se arrefecer por 20 min no banco para completar recuperação antigênica. </li><li> Lavar 2-3x com PBS. Retire o excesso de tampão e transfer desliza da cremalheira para a posição horizontal em uma caixa de slide ou outra câmara úmida para evitar a dessecação. </li><li> Bloquear 45-60 min à temperatura ambiente com 10% de soro de burro normal (também 5% de albumina de soro bovino, ou de preferência a partir de soro animal, em que o anticorpo secundário foi gerado) em PBS. </li><li> Incubar as amostras de anticorpo GFP primário em uma diluição de 1:100 em PBS durante a noite a 4 ° C em câmara húmida. Gentilmente aplicar pequenos pedaços de Parafilm sobre o tecido com o anticorpo para promover o contato homogêneo com o tecido e evitar a evaporação. Nota: Os restantes passos são realizados à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5x com PBS para remover excesso de anticorpo primário. Incubar com anticorpo secundário 1:500-1:1,000 em PBS durante 1-2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 5x com PBS para remover excesso de anticorpo secundário. Se desejado, as lâminas contracoloração neste passo. </li><li> Se estiver usando anticorpo secundário fluorescente, incubar 0,1% Sudan Black em 70% EtOH fou 15-20 minutos para reduzir autofluorescência. Limpe o excesso de Sudan Black de todo o tecido e lave 5x com PBS mais de 20 min. </li><li> Monte amostra com lamela e armazenar na horizontal, até solução de montagem definiu. </li></ol> 4. Protocolo Alternativa: Detecção direta de GFP-LC3 <ol><li> Canular e inflar os pulmões com um ~ 500 ml de 50/50 v / v outubro PBS. </li><li> Encaixe em OCT, colocando uma pequena quantidade de OCT na parte inferior de um cryomold. </li><li> Com cuidado, coloque o complexo pulmonar dissecado no molde. </li><li> Lentamente congelar methylbutane refrigerados, utilizando gelo seco. </li><li> Adicionar mais outubro até que o tecido está completamente coberto e sólido congelado. Manter em gelo seco e armazenar a -80 ° C. </li><li> Usando um cryomicrotome, corte de 5-10 mm de espessura protegendo as seções da luz. Seções da loja e tecido remanescente a -80 ° C. </li><li> Para preparar os slides para imagens, remova a seção do freezer e aplique imediatamente uma gota de PBS para evitar a dessecação. </li><li> Correção para 30 min com PFA 4%. Lavar com PBS. </li><li> Aplicar DAPI / Hoescht para 10 min. Lavar 3x com PBS. </li><li> Monte amostra com lamela e armazenar na horizontal, até solução de montagem definiu. </li><li> Imagem utilizando epifluorescência ou microscópio confocal. Armazenar as amostras a 4 ° C durante até um mês. </li></ol> 5. Preparação de Tecidos para Microscopia Eletrônica <ol><li> Cortar tecidos em aproximadamente 1 mm cubos para a fixação. </li><li> Fixar o tecido em formaldeído a 2%, glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4. </li><li> Lave com tampão cacodilato de sódio 0,1 M, durante 1-2 horas. Nota: o tecido fixa pode ser armazenado em 0,1 M de cacodilato de sódio a 4 ° C. </li><li> Publique correcção em 1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,2 M durante 1 hora. </li><li> Enxaguar em tampão de cacodilato de sódio 0,2 M durante 10 min 3x. </li><li> Desidratar em etanol 70%, 20 min 2x. Desidratar em EtOH a 90%, 2x 10 minutos. Desidratar em EtOH a 100%,20 min 2x. </li><li> Incubar com óxido de propileno (propano epóxi) durante 10 minutos em 2x. </li><li> Incubar com a mistura de resina de óxido de propileno / epóxi (50:50), durante 1 hora. A mistura de resina epoxi é: 24 g de Agar de resina de 100, 13 g de anidrido dodecenilsuccínico, 13 g de anidrido methylnadic e 1 ml de N-benzildimetilamina. Misture bem em uma taça descartável com uma espátula de madeira. </li><li> Incube com Epoxy overnight resina vials estreantes (deste permite algum óxido propileno restante evaporar). </li><li> Incorporar em cápsulas marcados com resina preparada na hora. Polimerizar a 60 ° C durante 48 hr. </li><li> Cortes de tecido fotografia usando um microscópio eletrônico de transmissão em 80 kV ou 60 no filme microscópio eletrônico. Imprimir as imagens em papel fotográfico ou armazenar mídia como digitais. </li><li> Analisar a formação autophagosome em células intactas contendo núcleo. Campos de baixa potência (e. G. 2,000-4,000 X) pode ser usada para identificar células nucleadas. Normalmente 6,800-10,000 imagens X são usados ​​para poé a quantificação autophagosome. Contagem autofagossomas por unidade de área 15-30 campos de representação estatística adequada. Autofagossomas tem estrutura de membrana dupla, onde autophogosomes fase tardia assemelhava vacúolos preenchidos. </li></ol>

<ol>
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Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para declarar

A principal vantagem do CLP é que ele permite que os pesquisadores para investigar sepse de diferentes gravidades (ou seja, de baixo para médio e alto grau). A gravidade da sepsia induzida é afectada pelo comprimento do ceco ligado (que o determinante mais importante), o tamanho da agulha utilizado para punção e o número de orifícios 15 realizados. Além disso, a tensão do mouse e sexo podem ter impacto sobre a gravidade da sepse; várias cepas são mais suscetíveis do que outras e os homens...

Sepse, uma resposta inflamatória sistêmica à infecção, representa uma das principais causas de morte em pacientes criticamente doentes 1. Infecções intra-abdominais, muitas vezes levando à sepse polimicrobiana, são responsáveis ​​por 20% dos casos de sepse, que têm uma mortalidade significativa de até 60% 2. Mortalidade associada à sepse resulta principalmente de disfunção de múltiplos órgãos com falência de órgãos posterior 3,4. Investigações adicionais sobre o mecanismo patogênico da doença é urgentemente necessária para promover o desenvolvimento de novas terapias e mais eficazes. O método de ligadura e perfuração cecal (CLP) é um procedimento comumente utilizado para sepse modelagem in vivo. Como o ceco é cheia de bactérias, os seus resultados de punção em peritonite polimicrobianas, a translocação de bactérias no sangue (bacteremia), choque séptico, disfunção de múltiplos órgãos e, em última análise, a morte 5. É geralmente aceite que a CLP reflete clínicarealidade com mais precisão do que as técnicas anteriores, como a injeção de endotoxina ou bactérias ainda purificadas em roedores, Assim, CLP é considerada o padrão-ouro (embora não sem limitações) 6 para a indução experimental e, portanto, a investigação da patogênese da sepse. Nesta monografia, descrevemos os protocolos destinados a avaliar se os mecanismos patogênicos de sepse incluem autofagia. A autofagia, um processo celular evolutivamente conservada, facilita o volume de negócios de proteínas e organelas como as mitocôndrias danificadas e desempenha um papel importante na depuração de patógenos intracelulares incluindo bactérias 7,8. Durante a autofagia, proteínas ou organelas citosólicas são seqüestrados em vesículas ligadas à membrana dupla chamadas autofagossomas, que são posteriormente entregues aos lisossomos para degradação 9. Um número de proteínas foram identificadas como os seus homólogos de mamíferos de genes relacionados com a autofagia (ATG),originalmente identificado em leveduras, que regulam o processo de autofagia. A conversão de microtúbulos associados protein-1 cadeia leve 3B (LC3B) (homólogo de Atg8) a partir de-I LC3B (forma livre) para LC3B-II (forma fosfatidiletanolamina conjugado) representa um grande passo na formação autophagosome 9. Disfunção autofágica é associado com o envelhecimento e doenças humanas, incluindo câncer e doenças neurodegenerativas 10. Além disso, a autofagia afecta a imunidade inata e adaptativa, tais como apresentação de antigénio, o desenvolvimento de linfócitos e a secreção de citoquinas pelas células imunes 8. Assim, parece razoável que a autofagia pode também desempenhar um papel na resposta inflamatória sistémica à infecção (isto é, em sépsis). Até à data, vários métodos têm sido descritos para avaliar o papel da autofagia em lesão de tecidos in vivo. Estes incluem o uso de proteína de fluorescência verde (GFP)-LC3 expressando camundongos ea quantificação de autophagosomes em tecidos por microscopia electrónica (estes dois métodos são descritos na presente monografia). Métodos adicionais incluem a quantificação da expressão da proteína autophagic em homogenatos de tecidos, e a análise de fluxo autophagic (como descrito noutro local) 11-13. O objetivo desta revisão é fornecer protocolos atuais para avaliar a autofagia in vivo, no contexto da sepse experimental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP), que causa a sepse polimicrobiana. Aqui, um protocolo é fornecido para induzir sepsia de gravidade variável em ratinhos utilizando a técnica de CLP. A autofagia é uma resposta do tecido fundamental para o estresse ea invasão do patógeno. Dois protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia experimental também são aqui apresentados. (I) camundongos transgênicos expressando a proteína fluorescente verde proteína de fusão (GFP)-LC3 são submetidos a CLP. Realce localizada do sinal GFP (puncta), tal como ensaiado ou com imuno-histoquímica ou confocal, pode ser utilizado para detectar a formação de autophagosome aumentado e, assim, a activação da via alterada autofagia. (II) aprimorado vacúolo autofágico (autophagosome) formação por área de tecido da unidade (como um marcador de estimulação autofagia) pode ser quantificado usando microscopia eletrônica. O estudo das respostas autofágicos a sepse é uma amostra críticaonent de compreensão dos mecanismos pelos quais os tecidos respondem à infecção. Os resultados da pesquisa nesta área pode vir a contribuir para a compreensão da patogênese da sepse, o que representa um grande problema em medicina intensiva.

Bacteremia está presente em camundongos, já em 6 horas após a sepse induzida por CLP 14. Os sinais clínicos de sepse (incluindo calafrios, taquipnéia e atividade motora) aparecem cerca de 12 horas após o procedimento. Ratos submetidos a CLP começam a morrer em cerca de 18 horas após a indução da peritonite. O mais grave é a sepse é o mais aumentou a letalidade 15. Em detalhe, sepse alto grau provoca uma mortalidade de 100% dentro de 2-3 dias, enquanto que os resultados de sépsis, de gr...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica.

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K visualizações.  Brigham and Women's Hospital.  Sepse experimental pode ser induzida em camundongos usando a ligadura e punção do ceco método (CLP). Protocolos correntes para avaliar a autofagia in vivo no contexto de sepsia induzida por CLP são aqui apresentados: Um protocolo para medir autofagia utilizando ratinhos (GFP)-LC3, e um protocolo para medir a formação de autophagosome por microscopia electrónica. 

Vídeo: Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

Colon ascendens Stent peritonite (CASP) - um modelo padronizado para sepse abdominal polimicrobianas

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Imunologia e Infecção

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissecando interação hospedeiro-vírus em replicação lítica de um herpesvírus modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Um modelo de Mouse controlado para sepse Neonatal Polymicrobial

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudo do complexo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...