Este trabalho foi apoiado por números conceder R01AI055001 e R01AI082127 de NIAID a NRM e Award Fellowship SREB Dissertação de JLB.

1. Fluoresceína rotulados dextran e GSL I-isolectin B 4 injeções veia facial para rotular vasculatura embrionárias <ol><li> Prepare FITC-dextran (50ug/mL) em tampão fosfato salino (PBS) ou GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) em PBS em um tubo Eppendorf 1,5 ml e aquecer a 37 ° C. Adicionar 100uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS para a solução FITC-dextran (volume total de 1ml) e 180uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS a um GSL - isolectin B 4 (200uL volume total), de modo que a solução é visivelmente azul. </li><li> E14.5-E18.5 dissecar embriões e saco vitelino juntos, deixando o talo alantóide (artéria e veia umbilical) intacta. </li><li> Transferência de embriões para um prato novo Petrie (60 X 15 mm) e mergulha-as na PBS em temperatura ambiente. </li><li> Posição do embrião para fornecer uma visão sagital da cabeça / face. Use uma pinça de dissecação micro suavemente para entender o embrião na cabeça. </li><li> Usando uma agulha 30G, injetar 50uL FITC-dextran (50ug/mL) ou GSL 1 - isolectin B 4 (20ug em 200uL PBS) na veia facial apontando a agulha para a parte traseira da cabeça. </li><li> Quando a tintura é visível na veia umbilical, retire a agulha e separar o embrião do talo alantóide (artéria e veia umbilical). </li><li> Após as injeções, permitem embrião permanecer em PBS à temperatura ambiente por 2-3 minutos para que o corante circula por todo o embrião. </li></ol> 2. Todo-mount análise da vascularização da pele <ol><li> Depois de permitir que o corante para circular por todo o embrião, retire amostras de pele das regiões dos membros, costas e estômago, etc 8,9. </li><li> Lavar amostra de pele no frio PBS, e fixar em 4% PFA / PBS por 2 horas 8,9. Lavar 3 vezes durante 10 minutos cada, em frasco com 2 ml clara 4mL frio PBS. </li><li> Colocar a amostra de pele em um microscópio de slides e adicione 100 ml de montagem de mídia para cada slide e uma tampa de vidro. </li><li> Permitir slides para secar em uma área de armazenamento. </li><li> Vá para a Etapa seção &quot;Aquisição de Imagem&quot; 2. </li></ol> 3. Multi-cor rotulagem de timo e vascularização do coração e células perivascular para criosecções (Continue da Seção 1, Passo 7) <ol><li> Embrião &#39;Flash congelar &quot;todo em nitrogênio líquido. Embriões podem ser e armazenadas a -80 ° C até a análise. </li><li> Alternativamente, dissecar timo, enxágüe em 4 ° C PBS, e fixar em 2 mL paraformaldeído 4% (PFA) / PBS por 2 horas. Lavar 3 vezes durante 10 minutos no frio PBS, thymi lugar em outubro, e congelar e armazenar até usar a -80 ° C. </li><li> Para cryosectioning, espalhados em outubro &#39;block&#39; uma seção e montar o embrião ou órgãos dissecados / tecidos para corte. </li><li> Corte de tecido congelado em 10 mM de espessura e recolher em slides. </li><li> Fix seções em acetona por 5-10 minutos. Lavar 3 vezes em TBS frio. </li><li> Bloco em 10% de soro de burro / TBS em uma câmara de umidade em temperatura ambiente. </li><li> Incubar seções de 1 hora durante a noite com 100 ul de anticorpos primários em câmara úmida a 4 ° C: neste exemplo, usamos ratos anti-rato-CD31 (1:100) ao endotélio rótulo, e de cabra anti-rato PDGFR β- (1:100) para rotular as células perivascular. É útil para cobrir slides com tiras cortadas individualmente Parafilm para garantir que o anticorpo é uniformemente distribuídos em toda a seção. </li><li> Após a incubação com o anticorpo primário, lave seções 3 vezes em TBS frio. Incube com 100 ul de anticorpos secundários apropriada por 30 minutos mínimo. </li><li> Lavar 3 vezes em TBS frio. Adicione 100 ml de montagem de mídia para cada slide e uma tampa de vidro. </li><li> Permitir slides para secar em uma área de armazenamento. </li><li> Vá para a seção &quot;Aquisição de Imagem&quot;. </li></ol> 4. Multi-cor rotulagem de timo vascularização e células perivascular para seções vibratome (Continue da Seção 1, Passo 7) <ol><li> Dissecar lobos do timo, do embrião e enxaguar em água fria PBS. </li><li> Fix timo em 4% PFA / PBS em temperatura ambiente por 2 horas. </li><li> Lavar em PBS-Triton X (0,15%) 3 vezes, 10 minutos e thymi lugar em um cartucho de plástico pequeno e submergir em 4% baixo derreter agarose / PBS (~ 4 ° C). Timo deve estar em contato com a parte inferior do cartucho. </li><li> Permitir agarose para solidificar em gelo (3-5 minutos). Use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de agarose. Adicionar cola no bloco vibratome e aderir ao bloco de amostra. </li><li> Adicionar frio PBS para vibratome banho-maria até que a amostra ea lâmina estão imersos. </li><li> Definir a velocidade e amplitude (amplitude de alta e baixa velocidade moderada é ideal para o soft seções timo). A amplitude deve ser reduzida se as seções quebrar devido à agitação em excesso. </li><li> Corte de 50 seções um. </li><li> Usando um pincel, recolher seções em uma microplaca de 24 poços no frio PBS. </li><li> Seções de bloco em 500 l de soro de burro de 10% em PBS-Triton X (0,15%) por 30 minutos. </li><li> Seções incubar por 8 horas durante a noite com o anticorpo primário, tais como anti-CD31 e anti-PDGFR-β, Em uma coberta de microplacas de 24 poços. </li><li> Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) sobre um total de 8 horas a 4 ° C. </li><li> Seções de bloco no soro de burro de 10% em PBS-Triton X (0,15%) por 30 minutos. </li><li> Incubar seções de oito horas durante a noite a 4 ° C com anticorpos secundários apropriado. </li><li> Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) sobre um total de 8 horas a 4 ° C. </li><li> Re-fix amostras em PFA 4% / PBS por 30 minutos no gelo. </li><li> Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) mais de 30 minutos no gelo. </li><li> Desidratar as amostras através de um classificado MeOH / PBS-Triton X série: 25% MeOH, MeOH 50%, 75% MeOH, MeOH e 100% menos 10 minutos para cada etapa. Substituir MeOH 100% com MeOH fresco depois de 10 minutos e incubar por 1 hora em temperatura ambiente. </li><li> Em um recipiente de vidro, misture Babb (Benzyl Álcool: benzoato de benzila) em uma proporção de 1:2. Combine Babb com MeOH para uma concentração final de Babb 50% e MeOH 50%. Incubar a amostra em Babb: MeOH por 10-15 minutos. </li><li> Transferência da amostra para um recipiente de vidro com 100% de Babb e incubar por 10-15 minutos ou até eliminado, em temperatura ambiente. </li><li> Preencha deslize depressão (0,7 milímetros de profundidade) com Babb 100% frescos e de transferência de amostra para o lado. Adicionar tampa de vidro (n º 1.5) e selar com 2-3 camadas de unha polonês. Permitir unha polonês para endurecer no escuro à temperatura ambiente, em seguida, armazenar amostras a 4 ° C. Nota: Os slides devem ser completamente selados antes da aquisição da imagem confocal. As imagens devem ser adquiridas dentro de 12-24 horas, como corantes fluorescentes podem desaparecer em Babb. </li><li> Vá para a seção &quot;Aquisição de Imagem&quot;. </li></ol> 5. Aquisição de imagem <ol><li> Imagem 10 mM cortes congelados com um microscópio confocal utilizando o Plano de Apochromat-20X/0.8 objetivo (512 X 512 pixels) com 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, e as linhas 633-nm laser. </li><li> Adquirir confocal z-seções da pele montagem inteira e 50 mm de agarose-embedded seções usando o Plano Apochromat-10X/0.4 objetivo (512 X 512 pixels) com 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, e 633 nm linhas laser. Série Z-seções devem ser coletadas sequencialmente em 1-micron para cada respectivo canal. </li><li> Reconstruir série Z-seções usando Zeiss Axiovision 4.6 ou software de análise de imagem. </li></ol> 6. Resultados representativos: Rotulagem eficiente da vasculatura embrionárias é fundamental para avaliar os defeitos dos vasos sanguíneos em ratos embrionárias. A Figura 1 mostra a rotulagem específica de E16.5 vasos sanguíneos timo (1A-B) e co-rotulagem com CD31 (1B), além da coloração dos ventrículos direito e esquerdo (1E-F), respectivamente. A GSL I-B 4 isolectin protocolo para criosecções conforme descrito nas seções 1, 3 e 5 foi usado nesses experimentos. Todo-mount rotulagem da rede navio pele sangue em ratos E16.5, utilizando os protocolos descritos nos pontos 1, 2 e 5 é mostrado na Figura 1C-D. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg" /> Figura 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B 4 injeções em veia facial E16.5 embriões de camundongos. a. Cryosection do timo embrionárias após a injecção. b. direta de CD31 co-rotulagem com B isolectin 4. c. e d. Whole-mount da injeção embrionárias da pele vasculatura seguinte. e. e f. Cryosection embrionárias de coração e. (à direita ventrículo) f. (ventrículo esquerdo) após a injecção.

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	<li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus.">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture.">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li><li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus.">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li><li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus.">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization.">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li><li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development.">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li><li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice.">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li><li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback.">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice.">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Todo o monte e PECAM-1 (CD31) coloração em cortes são os métodos convencionais para a rotulagem da vasculatura embrionárias em camundongos. Estes métodos requerem o uso de imunofluorescência direta e / ou indireta, e detergentes para permeabilizar o tecido mouse. Isso prova a ser um processo bastante oportuna. Aqui, nós empregamos FITC-dextran ou isolectin B 4 injeções veia facial diretamente rótulo a vasculatura embrionárias, eliminando a exigência de rotulagem passos de anticorpos. Além disso,...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> FITC-dextran </td><td> Sigma </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> Fluoresceína rotulados GSL 1 - B isolectin 4 </td><td> Vector Laboratories </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> Verde rápido </td><td> Biomedicals MP </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Composto Temperatura ideal de corte (OCT </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> JT Baker </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> Donkey Serum </td><td> Jackson </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> rato anti-CD31 do mouse, </td><td> BD PharMingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> cabra anti-rato PDGFR β- </td><td> R &amp; D Systems </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> donkey anti-CD31 rato Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> burro anti-cabra Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> Triton X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> Baixo derreter agarose / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25G </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> Álcool benzílico </td><td> Acros Scientific </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> Benzoato de benzila </td><td> Acros Scientific </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> Slides depressão </td><td> Fisher Scientific </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> Cobertura de vidro (22x22) -1,5 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 Meta Microscópio Confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Micro pinça de dissecação </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm No. OM992 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 e 24 microplacas bem </td><td> Scientific Evergreen </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Superfrost / Plus Lâminas de Microscopia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL frascos claros </td><td> Científica Nacional </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

a method for labeling vasculature in embryonic mice

O estabelecimento de uma rede funcional dos vasos sanguíneos é uma parte essencial da organogênese, e é necessário para a função do órgão ideal. Por exemplo, na formação adequada vascularização do timo e padronização é essencial para a entrada timócito no órgão e saída de células T maduras para a periferia. O arranjo espacial dos vasos sanguíneos no timo é dependente de sinais a partir do microambiente local, ou seja, células epiteliais tímicas (TEC). Vários relatórios recentes sugerem que a interrupção desses resultados no timo sinais de sangue 1,2 defeitos navio. Estudos anteriores descreveram técnicas usadas para rotular os 1,2 vasculatura neonatal e adulto timo. Nós demonstramos aqui uma técnica para a rotulagem dos vasos sanguíneos no timo embrionárias. Este método combina o uso de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectina I (GSL 1 - isolectin B 4) injeções veia facial e coloração de anticorpos CD31 para identificar timo estruturas vasculares e PDGFR-β para rotular tímica perivascular mesênquima 3-5. A opção de usar ou seções criosecções vibratome também é fornecido. Este protocolo pode ser usado para identificar defeitos do timo vascular, que é crítico para a definição dos papéis dos TEC derivadas moléculas na formação do timo dos vasos sanguíneos. Como o método de rótulos toda a vasculatura, ele também pode ser usado para analisar as redes vascular em vários órgãos e tecidos em todo o embrião, incluindo pele e do coração 60-10.

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A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.

Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K visualizações.  University of Georgia. Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.