Name: Vídeo: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00
Duration: 10 min
Description: 15.3K visualizações. University of California Davis. Nós demonstramos a fabricação de um estágio de baixo custo criogênicos projetados para caber mais microscópios de luz refletida. Nesta fase de laboratório construído criogênicos permite eficiente e confiável imagem correlativa entre crio-luz e crio-microscopia eletrônica.

Os autores agradecem a Brandon J. Zipp e Ken B. Kaplan para fornecer acesso à cepa de levedura utilizada neste estudo. Os autores também agradecem Julio Lenin Dominguez-Ramirez para a assistência com filmagem. JEE reconhece NIH apoio financeiro da concessão número 5RC1GM91755.

1. Fabricação e Montagem <ol><li> Coloque o dissipador de calor de alumínio dentro do 22,96 centímetros (9 &quot;) pie pan aproximadamente 2 cm do lado da panela, como mostrado na Figura 1c Usando uma caneta preta, marque os orifícios para o dissipador de calor de alumínio Nota:.. Se o alumínio bloco (comprado em uma loja local de sucata de metal ou online em <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) não vem com furos pré-perfurados, você terá que providenciar a furos e rebaixada antes da etapa 1 para assegurar o alumínio bloco para o pan torta. Costumávamos 5 furos para fixar o bloco para a plataforma e 4 furos extra para permitir bolhas de gás nitrogênio para escapar sob o alumínio. </li><li> Coloque a caixa crio grade perto do local do dissipador de calor de alumínio e marcar o entalhe e cada lado. </li><li> Faça furos piloto para cada posição marcada com um bit # 17 broca para o alumínio furos do dissipador de calor e um pouco # 35 broca para os furos de crio-grade de caixa. </li><li> Montar o dissipador de calor de alumínio com 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 &quot;) de cabeça chata parafusos de fenda e porcas correspondentes, bem como 15 - # 10 arruelas Coloque duas arruelas sob o bloco de alumínio ea terceira na parte traseira do. pie pan para cada buraco Nota:. overhangs inseguros do bloco de alumínio próximo a área de visualização pode resultar em vibrações que limitam a capacidade de imagem do palco Verifique se todos os parafusos de fixação estão bem apertados.. </li><li> Inserir 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 &quot;) completam os parafusos e porcas slotted correspondente da parte traseira da bandeja da torta para atuar como o crio-grade caixa de montagem. </li><li> Tape 4 pauzinhos juntos em pares com um pauzinho em cima de outro. Par de fita para cada margens opostas do pan bolo para atuar como espaçadores. </li><li> Superfície molhada superior e inferior do bolo e torta de panelas, respectivamente, com DDH 2 O. </li><li> Encha a bandeja de bolo com duas camadas de espuma isolante spray. Molhar cada camada antes de ir para a próxima etapa. </li><li> Pressione a bandeja da torta na espuma. </li><li> Virar as panelas de cabeça para baixo e pressione no pan bolo até os espaçadores em contato com o pan torta. Coloque qualquer objeto pesado em cima da bandeja de bolo e deixe descansar durante a noite para a cura. </li><li> Com uma faca serrilhada, corte o excesso de spray de espuma isolante secas a partir da borda das panelas e remover os pauzinhos. </li><li> Retire a panela do bolo da bandeja da torta. O pan torta com dissipador de calor de alumínio é agora isolado e será referido como o &quot;estágio criogênico&quot; (Fig. 1a). </li><li> Coloque uma prancheta de plástico transparente (qualquer cor e superior a 3 mm de espessura) sobre a parte superior do palco criogênicos. Marca com um marcador preto a localização da caixa de montagem crio-grade por desenhar um círculo de aproximadamente 1,5 vezes o diâmetro de uma única rodada crio grid-caixa. Cortar buraco com um 1,9 centímetros (3 / 4 &quot;) buraco viu. Esta área de transferência será referida como a&quot; tela de carregamento &quot;(Fig 1b). </li><li> Coloque uma nova área de transferência transparente em cima do palco criogênico e colocar no microscópio com o dissipador de calor diretamente sob as lentes objetivas. Com um marcador preto, marca o caminho dos objectivos enquanto giram. </li><li> Corte ao longo da linha marcada a remoção de um meio círculo da borda da área de transferência. Isso pode ser feito com um quebra-cabeças ou utilizando um 7,62 centímetros (3 &quot;) buraco viu várias vezes, como mostrado no vídeo. </li><li> Finalmente um furo 1,9 cm (3 / 4 &quot;) de distância do meio círculo, mas ainda dentro da área do prato. Esta será a porta para recarga de nitrogênio líquido (LN 2) se os níveis de queda, enquanto imagem. Esta área de transferência serão encaminhados como a &quot;tela de visualização&quot; (Fig 1c). </li></ol> 2. Preparação da Amostra <ol><li> Diluir células log fase de levedura cultivadas em sintético completa (SC) de mídia a uma concentração adequada de 1x10 6 células / mL em água. </li><li> 2 mL da levedura diluída são pipetados em um R2 / 1 400 mesh de carbono revestido de cobre holey Cryo-EM grade (SPI Supplies, West Chester, PA) e permitiu a absorver por 15 segundos. </li><li> Blot afastado o excesso de líquido da superfície da grade tocando na parte de trás da grade para um pedaço de tecido de celulose moles (Kimwipe) por 2 segundos. </li><li> Se necessário, a grade pode ser lavado com 3 gotas l de água (1-3 vezes), e maus longe como no passo 3 por blotting da parte de trás. </li><li> Antes da lavagem final, a amostra é carregado no freezer mergulhar pneumático ea grade pendurado é lavado como no passo 2.4. Depois de mata-borrão a grade com lenço de papel rasgado (Kimwipe) para remover a maioria da água da superfície, a grade é mergulhado em lN 2 etano líquido resfriado e transferido para uma caixa de crio-grade para armazenamento Nota 1:. É importante deixar uma camada de líquido o mais fino possível na superfície para manter a amostra hidratada. Indevido blotting vão quer secar a amostra ou deixar de gelo que é opaca para o feixe de elétrons. </li></ol> 3. Cryo-Light Microscopy <ol><li> Preencha o estágio criogênico comlN 2 e cobrir rapidamente com a tela de carregamento (área de transferência de plástico com um único 1,9 cm (3 / 4 &quot;) buraco). </li><li> Uma vez que o metal atinge lN temperatura 2, transferir a caixa crio grade por meio de 1,9 cm (3 / 4 &quot;) buraco da tela de carregamento e na transferência de montagem criada pela 3 parafusos descrito na A5 parte. Desaperte a caixa de crio-grade de seu titular e remova o suporte para um melhor acesso. Mantenha a caixa de titular crio grade sob lN 2 em um dewar separadas até a etapa 3.10. A caixa de crio-grade também devem ser mantidos sob lN 2 a prevenir o aquecimento grade amostra. </li><li> . Recarga lN 2 no estágio criogênico para logo abaixo do topo do dissipador de calor de alumínio Nota: lN dois níveis devem ser verificados periodicamente e recarregado durante o processo de imagem para garantir lN 2 é continuamente em contato com o dissipador de calor. Em geral, a recarga ocorre a cada 10 minutos através da porta de preencher a tela de visualização. </li><li> Pré-cool ponta da pinça em lN 2, em seguida, transferir sua grade (s) sobre a superfície de visualização plana do dissipador de calor de alumínio, com uma pinça, usando o 1.9 cm (3 / 4 &quot;) buraco da tela de carregamento. </li><li> Mover cuidadosamente o crio-estágio para debaixo aberturas objetivo do microscópio de luz refletida. </li><li> Coloque a tela de visualização transparente no topo da tela de carregamento. Em seguida, lentamente, remova a tela de carregamento, deslizando-lo debaixo do ecrã de visualização. Nota: Neste ponto, a amostra é mais vulneráveis. Todas as correntes de ar ao redor do microscópio deve ser minimizada, incluindo: respiração, uma abertura de porta próxima, as pessoas passando, etc Sugerimos vestindo uma máscara ou pendurando uma viseira transparente abaixo do oculares do microscópio como medida de precaução. </li><li> Gire a lentes objetivas no ambiente frio de nitrogênio gás do crio-estágio e digitalização para a amostra na área de visualização plana do dissipador de calor. Usando o padrão brilhante luz de microscopia de campo foco técnicas no grid com um objectivo de baixa ampliação para encontrar o centro e ter uma imagem panorâmica. Especificações sobre as lentes de microscopia de luz utilizada para este experimento estão listados na seção Materiais Experimental. Nota: lN dois não entram em contato com as lentes objetiva e ainda temos de ver a degradação de imagens ou dano às lentes dos efeitos do resfriamento . </li><li> Foco em alta ampliação em uma área de interesse e adquirir dados com campo claro, campo escuro, luz polarizada ou imagens de fluorescência. Certifique-se de registrar a localização da área de interesse na imagem de baixo campo ampliação brilhante para a correlação de futuro. Se todas as precauções listados acima para a recarga do lN dois são seguidos, então a pressão positiva a partir do nitrogênio evaporação é suficiente para manter um ambiente livre de contaminação (independente da umidade ambiente) para a duração da imagem. </li><li> Uma vez terminado, substituir a tela de carregamento, deslizando-a sobre a parte superior da tela de visualização. Remova a tela de visualização, diminuindo deslizando-a por baixo da tela de carregamento. </li><li> Remover o estágio crio a partir do microscópio e com pré-resfriada pinças, transferir a grade de volta para a caixa de crio-grade. Parafuso do titular caixa crio grade em crio-grade caixa para selar contra o meio ambiente e transferência do titular para um dewar LN2 para armazenamento e imagem futuro. </li></ol> 4. Cryo-Electron Microscopy <ol><li> Seguintes técnicas padronizadas e estabelecidas, carregar a grade de amostra em um suporte de transferência de crio-EM, mantendo a amostra à temperatura de nitrogênio líquido em todos os momentos. </li><li> Insira o crio titular com grade de exemplo em um Microscópio Eletrônico de Transmissão. </li><li> Em uma visão de ampliação adequado baixo (50-500x de ampliação nominal), encontrar o centro da grade de amostra. </li><li> Use o previamente coletadas baixa ampliação crio LM-dados a partir do passo 3.7 para determinar a orientação relativa das abas da rede de cobre da central (como descrito na Figura 2) e identificar áreas de interesse para exata correlação. </li><li> Prosseguir com o alinhamento microscópio, baixa dose de crio-EM de imagem e de coleta de dados. </li></ol> 5. Resultados representante O estágio criogênico (Fig 1a) é uma maneira eficaz de reunir crio-LM de dados para crio-fluorescência microscopia e análise cryo-LM/cryo-EM correlativos. A Figura 2 mostra como a combinação de baixa e alta ampliação crio-LM imagens permite construir mapas de referência que direcioná-lo para áreas específicas em crio-EM. O resultado crio-LM mapa de referência (Fig. 2b) foi utilizado durante a Cryo-EM aquisição de dados para localizar as regiões exata mostrada na Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Stage criogénicos. A) A disposição do palco criogênico consiste de uma caixa de transferência de crio-grade montagem indicada wseta om um branco e um dissipador de calor de alumínio. Grids são transferidos sob lN 2 da caixa de crio-grade e colocado diretamente sobre a área de visualização do dissipador de calor como indicado pela seta preta. B) Imagem representando o estágio criogênico com carga tela. O buraco na tela de carregamento é colocado diretamente sobre a crio-grade caixa de montar e funciona como uma porta para transferir as amostras e para o transporte de amostras a partir da caixa crio-grade para a área de amostra visualização no dissipador de calor com uma pinça. C) O criogênicos estágio na posição sob as lentes objetivas com a tela de visualização no lugar. O recorte especial na tela de visualização permite que as lentes objetivo de facilitar a troca na posição sem mover o estágio criogênico. O buraco na tela de visualização de distância da área de amostra funciona como um lN dois preencher porto para reabastecer lN 2 níveis, se necessário. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Navegando em crio-LM para estudos correlativos. A) baixa ampliação vista crio LM-de células de levedura aderiram a uma grade de amostra. B) A mesma imagem em (a) revestidas com uma imagem de alta ampliação de fluorescência de uma área de interesse e com um polígono preenchido laranja que marca o centro da grade da amostra. O centro é composto de um grupo de quatro quadrados, três tendo um guia de metal extra e o quarto aberto. Para os três quadrados com uma guia de metal extra, dois pares de partes do guia sobre os eixos longo e curto formando um centro assimétrico. Este centro assimétrico pode ser visto no canto superior esquerdo e foi usado para indicar o ângulo de rotação e lateralidade da grade entre crio-LM e crio-EM. Áreas de uma imagem de baixa ampliação muitos dos juros pode ser marcada e usada como um mapa de referência para localizar áreas idênticas em crio-EM. C) A imagem ampliada de fluorescência crio-LM da área de interesse em (b). HTA1-PCP, um c-terminal marcador PCP histona, pode ser visto como uma estrutura verde punctate rotulagem a localização do núcleo. D) Uma imagem Cryo-EM da área correspondente em (c). Barras de escala representam 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Correlação de crio-LM e crio-EM. Dois campos de vista mostrando células de levedura idênticos correlacionada com crio-brilhante campo (um d), crio-fluorescência (b, e), e crio-EM (c, f bares). Scale representam 5 microns.

<ol>
	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

Os autores declaram que não há interesses conflitantes financeiro.

<p class="jove_content"&gt; Usando nosso estágio criogênico e técnicas de preparação de amostras, estudos correlativos entre crio-LM e crio-EM apresentam várias vantagens sobre as abordagens tradicionais temperatura ambiente, incluindo mas não limitados a: fixação rápida<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Reduziu fotobranqueamento<sup&gt; 3</sup&gt;, E digitalização de integridade da amostra antes da Cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; Ou químico de fixação / incorporação<sup&gt; 6</sup&gt;. Um dos gargalos para a coleta de dados Cryo-EM é o tempo necessário para ambos transferir a amostra para um TEM e digitalização da rede para encontrar regiões adequadas para a imagem. Com a aquisição crio-LM de dados rápida<sup&gt; 5</sup&gt;, O tempo gasto encontrar células boas pode ser bastante reduzido. Assim, podemos economizar tempo e dinheiro e mitigar esse gargalo de pré-digitalizar e mapeamento de áreas de interesse em crio-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Mais caros ou complexos estágios criogênico pode permitir que imagens de alta resolução crio-LM. No entanto, o estágio fabricados aqui é mais do que adequado para muitas aplicações. Se crio-LM de imagem e transferências grade de amostragem são realizadas com cautela, como descrito no texto e vídeo, totalmente livre de contaminação de imagens pode ser realizado. Este método permite correlação direta de dados de microscopia fluorescente e eletrônica de uma mesma célula, organela ou complexo macromolecular dispersos sobre o suporte de carbono ou contidos dentro de uma secção de tecido fino<sup&gt; 7</sup&gt;. Note-se que o valor deste estágio criogênico se estende para além cryo-LM/cryo-EM estudos correlatos ao campo da microscopia de luz como um todo. Nesta fase criogênica é bem adequado para ambas as amostras delicada e corantes fluoróforo / manchas<sup&gt; 8</sup&gt;, Pontos quânticos, ou proteínas fluorescentes marcados<sup&gt; 9</sup&gt; Que pode ficar instável durante o quarto fixação química de temperatura e incorporação com glutaraldeído e paraformaldeído. Como resultado, esperamos que esta fase criogênica irá fornecer maior acesso aos interessados ​​em crio-LM, que tenham sido previamente dissuadido por um acesso de custos e insuficiente.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Solução de problemas Cryo-Light Microscopy</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Amostra de adsorção:</em&gt; Amostras diferentes podem apresentar características variáveis ​​de adsorção ao suporte de carbono. Você pode achar que é necessário usar outros tipos de redes de apoio, tais como carbono contínuo, holey de carbono, ou formvar grades revestidas de apoio amostra. Além disso, se a amostra é vinculativo para as barras de cobre da rede e não a superfície do carbono, pode ser necessário ajustar a química da superfície de carbono incubando a grade com um agente umectante ou por descarga glow antes da adição da amostra.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Estabilidade palco:</em&gt; Se você notar vibrações, é provável devido ao estágio da amostra que está sendo sobrecarregado com o peso do que o borbulhamento de LN2. O peso adicional do estágio criogênico, às vezes pode causar vibrações de baixa freqüência para transmitir ao longo do estágio do microscópio padrão de 3 eixos, viagens e afetar negativamente a imagem através de indefinição. Isto pode ser facilmente corrigido através do apoio a etapa do microscópio de viagens de baixo ou com uma mini-lift-ajustável ou um adaptador ajustável com duplo parafuso braços, como mostrado no vídeo. Esses dois mecanismos de apoio ajustável interagir com uma porção não-móveis da etapa de viagem e, portanto, ainda permite eixos X e Y-tradução, conforme necessário para geração de imagens.</p

Tabela de reagentes e equipamentos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catalogo </th><th> Comentários </th><th> Custo </th></tr><tr><td> 1-22,86 cm (9 &quot;) pan pizza com borda inclinada </td><td> Cozinhe bem </td><td></td><td> Mercearia local </td><td> $ 4,39 </td></tr><tr><td> 1-22,86 cm (9 &quot;) bandeja de bolo </td><td> Cozinhe bem </td><td></td><td> Mercearia local </td><td> $ 4,93 </td></tr><tr><td> 4 pares de pauzinhos </td><td></td><td></td><td> Mercearia local </td><td> $ 0,50 </td></tr><tr><td> 1 - Grandes Coisas espuma em spray </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> Loja de ferragem local </td><td> $ 5,98 </td></tr><tr><td> 1 - 4 centímetros x8cm x1cm bloco de alumínio </td><td></td><td></td><td> Loja de ferragem local ou depósito de sucata de metal </td><td> $ 10,00 </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1,91 centímetros (3 / 4 &quot;) de cabeça chata parafusos com fenda w / porcas </td><td></td><td></td><td> Loja de ferragem local </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0,95 centímetros (3 / 8 &quot;) ranhurada parafusos w / porcas </td><td></td><td></td><td> Loja de ferragem local </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 15 - # 10 arruelas </td><td></td><td></td><td> Loja de ferragem local </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 2 - transparente pranchetas de plástico </td><td></td><td></td><td> Loja escritório local </td><td> $ 6,84 </td></tr><tr><td> 1 - caixa porta-Cryo-EM grade </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM grade de vara de manipulação de caixa </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 filme de carbono holey, 400-malha de cobre da rede de apoio Cryo-EM </td><td> Suprimentos SPI </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Materiais experimentais <ol><li> Cepa de levedura: Hta1-PCP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-PCP:: KanMX6 do laboratório Kaplan na UC Davis). </li><li> Cryo-Light Microscopy: imagens Cryo-luz de microscopia foram tiradas em um microscópio Leica DM4000M refletindo com uma Leica DFC310 FX CCD da câmera. Campo brilhante, campo escuro e imagens de fluorescência foram adquiridas usando um HCX PL FLUOTAR 5x 0,15 NA objetivo de ar, um HCX PL FLUOTAR 10x 0,30 NA objetivo de ar, um PL FLUOTAR 50x 0,55 NA objetivo de ar ou um NPLAN 100x 0,75 NA objetivo ar. Campo vivas e imagens de campo escuro usada uma lâmpada de tungstênio 12V 100W como fonte de luz. Para fluorescência, uma fonte EL6000 lâmpada UV foi usada em conjunto com um JC1 Leica (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF 535/40 BP &amp; LP 580) Cube Filter. </li><li> Cryo-Microscopia Eletrônica de Transmissão: Cryo-EM imagens foram obtidas em um Microscópio Eletrônico de JEM-2100-FEG de transmissão (JEOL, Japão), operando em 200 KeV utilizando um Gatan 626 titular crio transferência (Gatan, EUA). Micrografias foram registradas em ampliações nominal de 50, 200, 1.200 e 4.000 X em um 4096 x 4096 pixels Tietz câmera CCD (TVIPS, Gauting, Alemanha). </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

O acoplamento de crio-microscopia de luz (crio-LM) e crio-microscopia eletrônica (Cryo-EM) apresenta uma série de vantagens para a compreensão da dinâmica celular e ultra-estrutura. Primeiro, as células podem ser visualizados em um ambiente quase nativo para ambas as técnicas. Segundo, devido ao processo de vitrificação, as amostras são preservadas por imobilização física rápida, em vez de fixação química lenta. Terceiro, a imagem da mesma amostra com ambos crio-LM e crio-EM fornece correlação de dados de uma única célula, ao invés de uma comparação de &quot;amostras representativas&quot;. Enquanto esses benefícios são bem conhecidos a partir de estudos anteriores, o uso generalizado de correlativo crio-LM e crio-EM continua a ser limitado devido ao custo e complexidade de comprar ou construir um palco adequado criogênicos microscopia de luz. Aqui demonstramos a montagem e utilização de um estágio criogênico barato que pode ser fabricado em qualquer laboratório para menos de US $ 40 com peças encontradas no local de hardware e mercearias. Nesta fase crio-LM é projetado para uso com microscópios de luz refletida, que são equipados com objectivos a longo aéreo que trabalham à distância. Para correlativo crio-LM e crio-EM estudos, adaptar o uso de carbono revestido padrão de 3 mm Cryo-EM suporta redes como amostra. Depois de adsorção da amostra para a rede, protocolos previamente estabelecidos para vitrificação da amostra e transferir / manipulação da grade são seguidos para permitir a técnica de multi-imagens. Como resultado, essa configuração permite que qualquer laboratório com um microscópio de luz refletida para ter acesso a imagens correlativo direto de amostras congeladas hidratado.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Nós demonstramos a fabricação de um estágio de baixo custo criogênicos projetados para caber mais microscópios de luz refletida. Nesta fase de laboratório construído criogênicos permite eficiente e confiável imagem correlativa entre crio-luz e crio-microscopia eletrônica.

Low-Cost Cryo-Light Fabricação Stage Microscopia de Luz Correlacionados / Microscopia Eletrônica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

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Research

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Bioengineering

15.3K visualizações.  University of California Davis. Nós demonstramos a fabricação de um estágio de baixo custo criogênicos projetados para caber mais microscópios de luz refletida. Nesta fase de laboratório construído criogênicos permite eficiente e confiável imagem correlativa entre crio-luz e crio-microscopia eletrônica.

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Bioengenharia

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Prototipagem rápida e de baixo custo de Dispositivos Médicos Usando 3D impresso moldes para moldagem por injeção líquida

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Design de uma impressora 3D de origem aberta, bioink de baixo custo e derretimento de alimentos

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...