Propomos um método para regular a atividade de polimerase usando fatores artificiais de transcrição de ácido nucleico. Esta arquitetura reguladora genética pode servir como um bloco de construção para futuros dispositivos genéticos in vitro. Ao amarrar um domínio de ligação de DNA a uma polimerase T7 RNA, esta técnica combina a escalabilidade de circuitos baseados em DNA, com a funcionalidade de circuitos transcricionais.
Comece fazendo nove diluições de oligonucleotídeo BG de um único fio para um volume final de 50 microliters de água dupla destilada, de cinco para um a cinco proporções, como indicado na tabela. Prepare uma mistura de reação para cada diluição misturando dois microliters de tampão SNAP com quatro microliters de oligonucleotídeo BG e quatro microliters de SNAP T7 RNAP. Prepare o controle RNAP substituindo o oligonucleotídeo por água dupla destilada, e o controle de DNA substituindo o SNAP T7 RNAP por água dupla destilada.
Configure 11 reações adicionando dois microliters de cada amostra a quatro microliters de buffer SNAP, e dois microliters de corante de carga de proteína por amostra. Aqueça as reações por 10 minutos a 70 graus Celsius, antes de carregar dois microlitadores de cada amostra em um gel de proteína de quatro a 12% vitreous por 35 minutos de eletroforese de gel no gelo a 200 volts. No final da corrida, lave o gel com três trocas de água em um shaker por pelo menos 10 minutos por lavagem, seguido de coloração de ácido nucleico com corante de cianinina por 15 minutos.
Imagem do gel em um sistema de imagem de gel apropriado, e manche o gel novamente com 20 mililitros de azul Coomassie. Após uma hora, des colorigar com água dupla destilada por pelo menos uma hora antes de imagem do gel novamente. Para purificação SNAP T7 de oligonucleotídeo, primeiro, prepare o tampão de elução misturando 50 microliters de um traço molar, com 100 microliters de cinco cloreto de sódio molar, com 850 microliters de água dupla destilada.
Em seguida, coloque uma coluna de troca de íons por amostra em dois tubos de centrífugas mililitros e lave as colunas com tampão de purificação por centrifugação até que todo o buffer tenha sido elucido de cada coluna. Diluir cada amostra com tampão de purificação em um tampão de purificação de três para um para a razão da amostra, e carregar 400 microliters de amostra em cada coluna. Quando todo o buffer tiver sido elucido como demonstrado, colete e rotule o fluxo através de cada amostra.
Lave as colunas três vezes com 400 microliters de tampão de purificação por lavagem até que todo o buffer tenha sido elucido por lavagem, coletando e rotulando as vias de fluxo conforme apropriado. Após a última lavagem, colete a proteína elucida adicionando 50 microliters de tampão de elução no centro da coluna, e centrifugando a coluna três vezes até que todos os 50 microliters de tampão tenha sido elucido. Colete e rotule o elto após cada centrifugação, agrupando o elto em um único tubo após a última centrifugação, deixando um pequeno volume de cada elute para análise de gel.
Meça a absorção dos alíquotas de elute restantes em 260 e 280 nanômetros, e adicione glicerol às amostras em uma proporção de um para um para menos 20 graus de armazenamento até o seu uso. Use uma unidade de filtro centrífrico de 500 microliter de 30 quilodalton para tampão trocar o produto elute total com buffer de armazenamento 2x. E medir a absorvência como demonstrado.
Em seguida, adicione glicerol ao produto em uma proporção de um para um para menos 20 graus Celsius de armazenamento. Para avaliar os elutos por SDS-PAGE, execute as amostras em uma escada proteica apropriada em um gel de quatro a 12% vítreo por 35 minutos a 200 volts, ou até que a frente de corante migre até o final do gel. Para demonstrar a atividade de controle sob demanda do RNAP amarrado, misture 2,4 microliters de cada modelo com cinco microliters de tampão de 5x e 14,2 microliters de água dupla destilada.
Incubar a gaiola de DNA de dois fios de micromolar a 75 graus Celsius por dois minutos. E anneal o sentido e as cepas anti-sentido do promotor e modelo de DNA de aptamer verde malachita da mesma maneira indicada na tabela. No final das incubações, adicione o SNAP T7 RNAP amarrado à gaiola de DNA duplamente encalhada em uma razão molar de um a cinco para uma concentração final de 500 RNAP nanomolar.
Depois de 15 minutos em temperatura ambiente, coloque a amostra no gelo, e misture 2,5 microlitadores de 10x tampão de transcrição in vitro com um microlitr de 25 milionolars de triptosfato de ribonucleoídeos, um microlitra de um verde de malacita mililitro, 2,5 microliters da mistura RNAP CAGE, 2,5 microliters cada um de um fator de transcrição micromolar A e B oligonucleotídeos, fios de oligonucleotídeos, e três microliters de um modelo de aptamer verde malachite mililitro em 10 microliters de água dupla destilada. Em 15 microliters de água dupla destilada, configurou uma segunda reação contendo 2,5 microliters de 10x tampão de transcrição in vitro, um microliter de 25 milimolars de triptomulado, um microliter de um verde malachite mililitro, 2,5 microliters da mistura RNAP CAGE, e três microliters de um modelo de aptamer verde malachite de malachite de mililitro. Para configurar uma reação contendo apenas tampão, misture 2,5 microliters de 10x tampão de transcrição in vitro, um microliter de 25 milimonas ribonucleoside triphosfato mix, um microlitr de um verde malachite mililitro, e três microliters de um modelo de aptamer verde malita de mililitro em 17,5 microlit de água dupla destilada.
Quando todas as reações tiverem sido preparadas, transfira cada reação para uma placa de 384 poços, e monitore a transcrição do aptamer verde malachita em um leitor de placa de fluorescência por duas horas a 37 graus Celsius a uma excitação de 610 nanômetros, e uma emissão de 655 nanômetros. No final da leitura, coloque a placa no gelo, e execute o produto RNA de cada poço em um gel poliacrílico desnaturing de 12%TBE-ureia em 70 graus Celsius TBE tampão a 280 volts por 20 minutos, ou até que a frente de corante atinja a extremidade do gel. Em seguida, colorir o gel com corante de cianina mancha de ácido nucleico por 10 minutos em um agitador orbital, antes da imagem como demonstrado.
Uma expressão bem sucedida e purificação da proteína SNAP T7 RNAP recombinante pode ser confirmada usando SDS-PAGE. Após o SDS-PAGE, a atividade enzimática pode ser validada pela reação de transcrição in vitro. O acoplamento bem-sucedido de oligonucleotídeos funcionalizados da BG pode ser verificado através de 18% de desnaturação TBE-ure PAGE.
Em comparação com o oligonucleotídeo não modificado, a adição da moiety BG ao oligonucleotídeo aumenta seu peso molecular. Como observado neste gel representativo de corante de cianina para confirmar a purificação T7 RNAP do excesso de oligonucleotídeos BG, o fluxo inicial através de fração continha principalmente ooligonucleotídeos bg em excesso, bem como uma pequena porção da polimerase amarrada ao DNA que não se ligava à resina de troca de cation. As frações de diluição da piscina continham apenas a única faixa de oligo RNAP causada pelo corante de cianinina que ligava à corda oligonucleotídeo, com a faixa de produto concentrada exibindo a mesma, mas banda mais escura significando uma alta concentração bem sucedida.
Os mesmos padrões são observados pela coloração azul Coomassie, com uma pequena mudança de mobilidade de gel observada no controle RNAP não conjugado. Aqui, o sinal fluorescente produzido no final da transcrição in vitro em cinética em tempo real é mostrado. Nesta análise, observou-se ativação de 336 vezes no sinal de fluorescência, demonstrando um controle robusto da atividade de polimerase.
Ao tentar este protocolo, lembre-se de lavar completamente o SDS do gel antes da coloração de ácido nucleico. Isso porque o STS vai prender o corante no gel, resultando em alto sinal de fundo. Aplicar nosso método a um grande circuito genético com múltiplas cascatas mostrará a escalabilidade e a composabilidade do sistema de transcrição amarrado.
Esta técnica está sendo usada atualmente para desenvolver circuitos genéticos capazes de computação de estilo de rede neural.
