YS-T é apoiada pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC), o Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Cancer Research Fund Israel (ICRF), alemão-israelense Fundação para Pesquisa e Desenvolvimento Científico (GIF ), EUA-Israel Binacional Science Foundation (BSF), alemão-israelense Projeto de Cooperação (DIP), e os ministérios israelenses de Ciência e Saúde, e é o Jane Stern Fellow Família Lebell em Ciências da Vida da Universidade Bar-Ilan University. YB é grato à Fundação Azrieli para a atribuição de uma bolsa Azrieli.

O sistema celular utilizado deve conter uma construção gene integrado que inclui MS2 seqüências de repetição para a marcação do mRNA em células vivas. Neste protocolo, usamos uma linha celular humana U2OS abrigando um gene de maneira estável β-actina integrada, que é fluorescente etiquetado no DNA, RNA e proteínas 8, da seguinte forma (Figura 1A): A 5 &#39;do gene contém operador lac ( Laco) repete - estas são usadas para marcar o gene (DNA) e, assim, identificar o locus de integração genômica. A proteína fluorescente etiquetado lac repressor (LacI) se ligará à repete Laco e tag do DNA. Os mRNAs são marcados com YFP-MS2 proteínas que se ligam ao MS2 repete (tronco-loops). O produto do gene é CFP-actina e, portanto, a indução do gene irá resultar no aparecimento de CFP-tagged citoesqueleto de actina. A modificação genética é transfectadas em uma linhagem de células U2OS Tet-On estável e sua expressão está sob controle transcricional Tet. 1. Revestimento de célula e transfecção: <ol><li> 48 horas antes das medições, semente ~ 2 * 10 5 células em placas de cultura de fundo de vidro tecido (35 milímetros pratos petri com 14 milímetros de vidro de fundo micropoços (,16-0,19 mm de espessura;. Cat. P35G-1.5-14-C , Mattek, Ashland, MA)). Adicionar 2 ml de meio para as células, a fim de atingir confluência 50-80%. </li><li> 24 horas antes do experimento, transitoriamente transfecção as células com construções que expressam os marcadores fluorescentes para marcação de DNA eo mRNA. Use FuGENE6 reagentes de transfecção (Roche). Os construtos utilizados: <ol type="a"><li> YFP-MS2-NLS irá marcar o tronco MS2-loops nas transcrições mRNA. A seqüência de localização nuclear (NLS) fornece a seqüência de entrada para a proteína nuclear YFP-MS2. </li><li> opcional - CFP-LacI ou RFP-LacI que ligará o laço se repete na 5 &#39;do gene e rotular o locus do gene. Lócus de marcação do gene auxilia no rastreamento do gene durante o experimento FRAP, mas não é necessário. </li></ol></li><li> Incubar as células durante pelo menos 12 horas, para obter boa expressão das proteínas transitória transfectadas (ver nota). </li><li> 6 - 12 horas antes do experimento adicionar 1,5 mcg / ml doxiciclina (Sigma) para as células para ativar do Tet induzível gene-PCP-actina. </li></ol> Notas: * É importante não se atingir níveis muito elevados de expressão das proteínas transfectadas para não mascarar o sinal obtido especificamente a partir do site a transcrição, em relação ao sinal de fundo. Níveis de expressão pode ser controlada por: a) ajustar o tempo entre a transfecção e da experiência; b) alterando a força do promotor (por exemplo, CMV é mais forte que o promotor L30); c) adição de um sinal de exportação nuclear (NES) para o YFP-MS2-NLS proteína, o que ajudará a distribuir o sinal YFP em toda a célula. * O fluoróforo usado para as medições devem ser preferencialmente fotoestável aquisições em todo tempo, por isso verde / amarelo fluoróforos que emitem são melhores do que fluoróforos vermelho. Informações sobre os fluoróforos diferentes podem ser encontrados na ref 10. * Determinar que os canais de luz diferente não sangram-through para o outro. Use slides contendo espécimes rotulados com cada um dos marcadores separadamente, medida em cada slide a intensidade de ambos os canais, e depois calcular a sangrar-through. 2. FRAP: O experimento pode ser realizado em qualquer microscópio que é capaz de adquirir imagens tanto e realizando fotobranqueamento com um feixe de laser. Normalmente, os experimentos FRAP são realizadas com um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). No entanto, como no nosso caso, o experimento é relativamente longo (15-30 min), e estamos seguindo um locus de pequeno porte dentro do núcleo, é importante ser capaz de manter o gene do site lócus / transcrição em foco durante todo o experimento. Isso exige uma rápida imagem em 3 dimensões ao longo do tempo (4D), e as taxas de aquisição, tais são difíceis de obter através de um microscópio de varredura confocal. Por isso, usamos um sistema 3D-FRAP (fotométricos), construído em um grande campo Olympus IX81 microscópio (63X Plan-Apo, 1,4 NA) equipado com um EM-CCD (Quant-EM, Roper), que pode adquirir imagens em alta velocidade (até 30 imagens / seg). O sistema tem 405 nm e 491 nm lasers que podem ser sincronizados com a câmera para permitir fotobranqueamento em uma região específica de interesse (ROI) da amostra. O microscópio é equipado com uma fonte Lambda DG-4 luz (Sutter) e um estágio XY e Z (prévia) que permite que imagens rápidas e precisas no Z-eixo. Todo o equipamento é integrado e controlado por Metamorph (dispositivos Molecular). Os experimentos em células vivas, são realizados a 37 ° C com 5% de CO 2, utilizando um sistema de câmara de live-célula (Tokai). <ol><li> Procedimento: Meia hora antes do experimento, ligue o microscópio de aquecimento do dispositivo e laser. Durante a experiênciamento a temperatura deve permanecer constante, caso contrário, pode causar mudanças de foco durante os tempos de aquisição de comprimento. Potência do laser deve ser estável para produção de energia consistente. </li><li> Sincronizar o laser com a câmara: <ol><li> Busca de uma área na placa que não contém células (utilizando DIC). </li><li> Use o canal de mesma luz que será usada para os experimentos. Aqui usamos o laser 491 nm para o canal YFP. </li><li> Aponte o laser para o meio da imagem. </li><li> Use o botão de sincronizar (desde macro). </li><li> Tente pontos diferentes no campo para garantir que o laser ea câmera são sincronizados. </li></ol></li><li> Escolha uma célula bom candidato para o experimento. Apesar de trabalhar com linhagens de células estáveis, descobrimos que nem todas as células têm níveis de expressão similar. Bons candidatos seriam as células que: a) exibem uma YFP-MS2-tagged clara local transcrição acima do difusa YFP-MS2 fundo, e b) ter YFP-MS2 livre suficiente de proteína na célula, de modo a ser capaz de recuperar totalmente após a fotobranqueamento (exemplo na figura 1B - compare as duas células, a célula à esquerda não é um bom candidato para clareamento). </li><li> Escolha condições adequadas de medição. O procedimento FRAP requer a aquisição de muitas imagens, e por isso é importante para o equilíbrio entre os tempos de exposição razoável e usando como luz mais baixa possível. Altos níveis de luz podem afetar a célula devido à fototoxicidade, e fará com que fotobranqueamento. Recomenda-se manter os parâmetros de imagem constante entre diferentes experimentos. Células são gravadas no canal YFP com 150 vezes a exposição ms, e no canal PCP para a detecção de CFP-laci (locus genômica). Após o locus CFP-LacI tag permite a detecção do gene, mesmo quando o YFP-MS2 sinal de mRNA é Foto-descoloração (opcional). Para cada aquisição, 7 Z-fatias são tomadas a cada 350 nm. O site de transcrição ativa é branqueada utilizando o laser nm 491. </li><li> Realizar o experimento completo, mas sem branqueamento. O experimento FRAP mede o tempo que leva para o site de transcrição para retornar ao estado estacionário. Primeiro, queremos verificar se o site de transcrição ativa é funcional e estável no estado estacionário. Por isso, realizamos um experimento FRAP completa, mas sem branqueamento para garantir que a intensidade medida do local a transcrição não muda durante o período do experimento. Nós usamos esta experiência para também testar nossas condições de imagem através da medição da fotobranqueamento total causado pela série de imagens completo. Como regra geral, o photobleach filme completo não deve ser superior a 30% da intensidade inicial. Isto pode ser medido através da razão de intensidade do mesmo ponto no núcleo da última imagem, divididos por primeira imagem (razão deve ser maior que 0,7). </li><li> FRAP: O sinal YFP-MS2 no local de transcrição ativa é branqueada utilizando o laser nm 491. 6 pré-bleach imagens são adquiridas. Pós-bleach imagens são adquiridas em uma seqüência de três freqüências de tempo: 15 imagens a cada 3 seg, 15 imagens a cada sec 6, e 26 (ou 45 para os experimentos de comprimento) imagens a cada 30 seg. As mudanças na freqüência de adquirir imagens permite adquirir imagens durante os tempos que mostram a mudança de maior intensidade (inicial de recuperação), e menos imagens para o final, quando as mudanças no sinal são menos proeminentes. </li></ol> Notas: Este experimento difere da FRAP &quot;regular&quot; em que: * FRAP de mRNA no local transcrição medidas a ligação do YFP-MS2 proteínas para o mRNA nascente, ao passo que experimentos FRAP típico medir a mobilidade de diferentes proteínas na célula. Portanto, não há interesse em medir a piscina difusivo de YFP-MS2 proteínas. Quando o tempo entre o branqueamento ea primeira imagem adquirida é relativamente longo, é possível desconsiderar essa piscina difusão do livre-YFP MS2 proteínas. * Uma vez que a recuperação do sinal YFP-MS2 é relativamente longo (15-30 min), é importante para manter o local de transcrição em foco. É por isso que uma série de Z-slices é adquirido em cada ponto do tempo. 3. Normalização dos dados FRAP: O 4D FRAP dados são analisados ​​usando o software livre de análise de imagem ImageJ (NIH, Bethesda, MD; <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Seguinte é a análise realizada com macros disponíveis através do software ImageJ, mas é claro que a auto-escrito macros podem ser geradas. <ol><li> Z-pilhas são projetadas máxima em cada ponto do tempo, resultando em um filme 2D ao longo do tempo para análise posterior. </li><li> O site de transcrição é controlado em cada quadro e a intensidade média é medido utilizando a ferramenta Rastreador Spot. 11 Os dados são salvos em uma folha de Excel para análise posterior. </li><li> Para cada ponto do tempo, as intensidades média de outras regiões de interesse (ROI) são medidos da seguinte forma (usando o Analisador de Séries Temporais plug-in de ImageJ): a) A parte de trássolo é retirado de um ROI fora da célula = B (t). b) Um ROI no nucleoplasma, mas, tanto quanto possível do local de bleach = C (t). c) O site de transcrição = S (t) (medida pelo rastreador spot). </li><li> Corrigir os dados para a fotodegradação causada durante o exame: Subtrair o fundo de todas as outras medidas e corrija a lixívia. Sc (t) é a intensidade corrigida do site transcrição no tempo t. </li></ol> eq. 1: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq1.jpg" alt="Equação 1" /><ol start="5"><li> Normalizar os dados: em primeiro lugar calcular a média das imagens pré-sanitária, o que mostra a intensidade do site transcrição no steady-state (= &lt;Sc (pre-bleach)&gt;). </li></ol> Então normalizar os dados: eq. 2 <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq2.jpg" alt="Equação 2" /> Os dados são normalizados por pelo menos 10 experimentos. Calcular a média dos experimentos eo desvio-padrão (STD) para as barras de erro em cada ponto do tempo (Figura 1C). Notas: A difusão da proteína YFP-MS2 durante a análise FRAP foi desconsiderada uma vez que a taxa de difusão de livre nucleoplásmica YFP-MS2 é muito rápido, enquanto o limite YFP-MS2 está associada com alta afinidade ao mRNA, e não reconectados à transcrição site. É por isso que a primeira imagem após o clareamento deve ser removido antes da análise. 4. Analisando os dados usando um modelo matemático: A fim de recuperar os parâmetros cinéticos a partir deste tipo de conjunto de dados, foi utilizado o modelo mais simples descrito que pode caber este tipo de dados. A explicação completa deste modelo específico pode ser lido aqui 5. O modelo contém as seguintes equações que descrevem o esquema na figura 2A: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq3.jpg" alt="Equação 3" /> <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq4.jpg" alt="Equação 4" /> Tendo os parâmetros do modelo, é possível calcular a taxa de alongamento: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq5.jpg" alt="Equação 5" /> Analisamos a curva usando Berkeley Madonna ( <a href="http://www.berkeleymadonna.com">http://www.berkeleymadonna.com</a> ), como já modelado 5, mas outras opções estão disponíveis (MatLab, Cell Virtual, COPASI etc.) Os dados foram ajustados ao modelo e constantes de velocidade foram extraídos. Damos o código em Berkeley Madonna. A fim de melhor ajustar os dados foi calculado o estado de equilíbrio e depois ajustar os dados experimentais normalizados para o modelo normalizado. 5. Resultados representativos: Nós Foto-descoloração do sinal de mRNA marcado no local de transcrição ativa usando laser de alta potência, e seguiu a recuperação da YFP-MS2 sinal ao longo do tempo. O sinal fluorescente no local transcrição consiste na cinética de estado estacionário da síntese de mRNA, assim como mRNA liberado do site. Medir a intensidade local de transcrição ao longo do tempo sem branqueamento dá um sinal de &#39;constante&#39; (figura 1C, os pontos vermelhos), que implica que este gene está atualmente em um estado relativo constante. Isto significa que o sinal que se acumula no mRNA recentemente transcrito é igual ao sinal que sai quando um mRNA é liberado a partir do site de transcrição. Quando Foto-descoloração, este sistema continua em seu estado estacionário, mas agora é possível medir o tempo que leva para o sinal para se recuperar. Portanto, a recuperação da fluorescência em sua maioria depende das propriedades de alongamento da polimerase. O sistema FRAP 3D permitiu a obtenção do volume 3D completa nuclear durante a recuperação FRAP e, portanto, nenhum sinal foi perdido durante os experimentos. Para calcular os parâmetros cinéticos a partir dos dados, a curva normalizada foi montado para o alongamento modelo cinético que descreve, que é baseado em equações diferenciais. 5 A vantagem de usar um modelo simples ODE é que ele pode estar apto para apenas um pequeno número de parâmetros . O passo inicial do modelo (ponto de entrada) é o alongamento, ou seja, o processo responsável pela síntese nova MS2-binding sites. A etapa final (ponto de saída) é a liberação mRNA no nucleoplasma. O modelo é baseado nas curvas de recuperação, que consistem em dois componentes cineticamente resolvido, uma rápida e mais lenta. O componente rápido refere-se a elongação, enquanto que o componente mais lento foi modelada como polimerase pausa durante o alongamento. Os dois estados da polimerase foram modeladas como alongamento com uma transição estocásticos para uma pausa. Nós otimizamos as equações diferenciais deste modelo, que rendeu uma velocidade de alongamento de 3,3 kb / minuto com uma transição estocásticos para uma taxa mais lenta de síntese (pausa para um tempo acumulado de 2,5 minutos). Modelagem mostrou that esta transição de alongamento para pausar afetado apenas 11% das polimerases que entrou alongamento. <table border="1"><tbody><tr><td> K fora </td><td> 0,0112 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_in </td><td> 0,0015 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_out </td><td> 0,0067 </td><td></td></tr><tr><td> Tempo de alongamento </td><td> (K + para fora k pause_out) -1 </td><td> 56 seg </td></tr><tr><td> Tempo de pausa </td><td> (K pause_out) -1 </td><td> 2,5 minutos </td></tr><tr><td> Probabilidade de fazer uma pausa </td><td> (K pause_in) / (K + k pause_in out) </td><td> 11% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. O modelo resulta em uma tabela de parâmetros. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) O sistema de célula experimental utilizada para acompanhar a expressão gênica in vivo. Representação esquemática do gene CFP-actina construir. A 5&#39;-end contém uma série de 256 repete Laco que estão vinculados por RFP-LacI (vermelho) e marcar o local da integração gene. Indução da transcrição do promotor CMV mínima é obtida pela ligação de reverter a tetraciclina ativador transcricional (rtTA ou Tet-On) para Tet-responsive elementos (TREs) na presença de dox. O mRNA transcrito contém a seqüência de codificação para CFP-β-actina, e 24 MS2 repete que estão vinculados pela proteína de fusão YFP-MS2. No final 3&#39;-, uma parte de um módulo de coelho β-globina exon-intron-exon é seguido por um sinal de clivagem-poli. O esquema também descreve o ensaio de alongamento mostrando fluorescentes MS2 proteínas (amarelo) ligado ao mRNAs transcritos recém transcrito pela RNA Pol II. (B) Um site de transcrição ativa (YFP-MS2, célula à direita) foi Foto-descoloração ea recuperação de fluorescência foi monitorado ao longo do tempo (frames na parte inferior). Nós medimos a intensidade de fluorescência de ambos lixívia (linha média) e não-branqueada (linha inferior) sites de transcrição ativa. Nota da célula da esquerda não é adequado para um experimento fotobranqueamento. (C) As medições experimentais realizadas no CFP-actina sites da transcrição de genes. Nas curvas azul a recuperação das medições YFP-MS2 FRAP. Em vermelho, uma célula não-branqueada a partir do mesmo experimento mostrando o sinal YFP-MS2 no local de transcrição no estado estacionário. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) Esquema do modelo que descreve a cinética de entrada e saída de mRNAs marcados com YFP-MS2 moléculas no local de transcrição. (B) YFP-MS2 dados FRAP e da simulação equipados (a média de dez experimentos foi montado o modelo) . Os resíduos calculados do ajuste são apresentados na parte inferior.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método para medir a atividade da polimerase cinética em células vivas podem ser divididos em duas partes. A primeira parte descreve o procedimento de &quot;molhado&quot;, que permite a medição e recuperação dos dados cinéticos de transcrição de mRNA, enquanto que na segunda parte, os dados são analisados ​​utilizando um modelo de ODE. 5 A série de estudos têm agora utilizada esta abordagem para extrair cinética de transcrição em células vivas 5, 6, 8, 12-14. A principal difer...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th></tr><tr><td> Doxiciclina </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE reagentes de transfecção 6 </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

measuring the kinetics of mrna transcription in single living cells

A atividade transcricional da RNA polimerase II (Pol II) é um processo dinâmico e, portanto, a medição da cinética do processo de transcrição in vivo é importante. Pol cinética II foram medidos utilizando métodos bioquímicos ou moleculares. 1-3 Nos últimos anos, com o desenvolvimento de novos métodos de visualização, tornou-se possível seguir a transcrição como ocorre em tempo real em células vivas único. 4 Aqui nós descrevemos como para realizar a análise de Pol II alongamento cinética em um gene específico nas células vivas. 5, 6 Usando uma linha de célula na qual um locus gene específico (DNA), seu produto mRNA, eo produto final pode ser a proteína fluorescente etiquetado e visualizados in vivo , é possível detectar a transcrição de mRNAs real sobre o gene de interesse. 7, 8 O mRNA é fluorescente etiquetado com o sistema MS2 mRNAs para marcação in vivo, onde o 3&#39;UTR de transcritos no mRNA de conter 24 MS2 haste-laço repete, que fornecem altamente específicos sítios de ligação para a proteína casaco YFP-MS2 que rotula o mRNA como é transcrito. 9 Para monitorar a cinética de transcrição usamos a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) método. Por fotobranqueamento as transcrições YFP-MS2-tagged nascente no local da transcrição e, em seguida, após a recuperação deste sinal ao longo do tempo, obtemos a taxa de síntese dos mRNAs recém-feitos. 5 Em outras palavras, YFP-MS2 recuperação de fluorescência reflete a geração de novos MS2-tronco-loops nas transcrições nascente e sua ligação por fluorescentes YFP-MS2 livre moléculas entrem a partir do nucleoplasma circundante. As curvas de recuperação FRAP são então analisados ​​por modelos mecanicistas matemática formalizada por uma série de equações diferenciais, a fim de recuperar os parâmetros de tempo cinética de transcrição.

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Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

measuring-the-kinetics-of-mrna-transcription-in-single-living-cells

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15.4K visualizações.  Bar-Ilan University. Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biologia

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...