Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NCI R00 CA132784) para KT

1. Isolamento de células mononucleares do sangue do cordão umbilical <ol><li> Preparar o tampão PBS-EDTA-se 5 ml de soro bovina solução de albumina (BSA) a 95 ml de tampão de lavagem (diluição de 1:20). Degas tampão e a manter o tampão no gelo IMPORTANTE:. Falha para desgaseificar o tampão pode resultar em menos do que os melhores resultados quando se isola CD19 + células-B, porque as bolhas podem bloquear a coluna de isolamento. </li><li> Preparar 50 ml por tubos cónicos de centrifugação de gradiente de densidade. Determinar o número de tubos necessários para processar o sangue do cordão umbilical (um tubo pode processar 8 ml de sangue) e adicionar 15 ml de Ficoll-Paque PLUS para cada tubo. </li><li> Diluir 8 ml de sangue de cordão, com 24 ml de DPBS (1X) e cuidadosamente a mistura da camada de sangue diluído cabo no topo do Ficoll-Paque PLUS em cada um dos tubos de 50 ml. Não misture o sangue e Ficoll-Paque PLUS IMPORTANTE:. Para evitar a mistura do sangue do cordão umbilical e Ficoll-Paque PLUS, manter o tubo em um ângulo de 45 graus emistura da camada do sangue lentamente. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 40 min a 20 ° C. As células mononucleares (MNC) permanecerá no plasma-Ficoll-Paque PLUS de interface enquanto granulócitos e eritrócitos de sedimentos, devido à densidade mais elevada a uma pressão osmótica de Ficoll-Paque PLUS. Etiqueta sete de 5 ml de fundo redondo de tubos a serem utilizados na parte 3, com a data de amostragem ID, e o seguinte: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tubo </td><td> Etiqueta </td><td> Propósito </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Imaculado </td><td> As células não coradas para citometria de fluxo durante a normalização </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Para determinar a viabilidade de citometria de fluxo durante </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Contém as células que serão classificados </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> Para a coleta de células CD34 + / CD19 +(Tarde pró-B - início de pré-BI), as células </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 45 baixo </td><td> Para a coleta de CD34 - / CD19 + / CD45 baixo (pré-BI), as células </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> Para a coleta de CD34 - / CD19 + / CD45 med (pré-BII), as células </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 de alta </td><td> Para a coleta de CD34 - / CD19 + / CD45 alta (B) células imaturas </td></tr></tbody></table> Casaco tubos 4, 5, 6, e 7 com 2% de FBS e colocar todos os tubos em gelo. <ol start="5"><li> Aspirar a camada de plasma superior com cuidado e evitar o contato com a camada de células mononucleares. Utilizando uma pipeta de vidro de 10 ml, transferir cuidadosamente a camada de células mononucleares de um novo tubo de 50 ml. Reúne-se as células mononucleares a partir de três tubos em conjunto dentro de um tubo simples 50 ml. </li><li> Encher o tubo com PBS, mistura suavemente e centrifugar a 300 xg durante 10 min a20 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Repita 1x. Após a primeira lavagem, ressuspender as pastilhas e transferir para um tubo de 50 ml único cónico. </li><li> Gentilmente ressuspender o sedimento de células em 200 ul de PBS. Remover 1 ml de suspensão de células, adicione-a 1 ml de PBS, num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e retiradas para contagem (contagem de células após a colocação da suspensão de células de 50 ml na centrífuga). Encher o tubo com PBS e centrifugar a 200 xg durante 15 min para remover as plaquetas. Remover o sobrenadante completamente sem perturbar o sedimento celular. </li></ol> 2. Modificado isolamento de células B a partir de células mononucleares utilizando a separação MACS <ol><li> Ressuspender o sedimento do passo 1.7 com 160 ul de frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS. </li><li> Adicionar 40 ul de B-CLL cocktail anticorpo biotina. Pipetar para misturar bem e incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lave as células - adicionar 1 ml frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS por 10 milhões de células (células number determinado no passo 1.7) e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante completamente e, em seguida, voltar a suspender o sedimento de células em 320 ul de frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS. </li><li> Adicionar 80 ul de anti-biotina micropérolas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lave as células - adicionar 1 ml frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS por 10 milhões de células e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Ressuspender até 100 milhões de células em 500 uL de frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS. Volume de tampão de acordo com a escala do número de células. </li><li> Prepare MACS Colunas e Separadores de MACS durante a centrifugação (Passo 2.5). Colocar uma coluna LS no campo magnético do separador MACS, adicionar 3 ml de frio (4 ° C) de tampão PBS-EDTA sobre a coluna e permitir que o tampão para gotejar através da coluna. Use um recipiente para pegar o fluxo através. Descartar o fluxo através. </li><li> Coloque um tubo cónico de 50 ml, abaixo da coluna e pipetar a suspensão de células na coluna. Permitir que as células não marcadas para gotejar through a coluna e para dentro do tubo cónico de 50 ml. IMPORTANTE: Estas são as células que irão ser utilizados para a rotulagem de anticorpos e separação de células. Não descarte o fluxo através. Para recuperar todas as células a partir do passo 2.5, adicionar 1 ml de uma adicional de frio (4 ° C) de tampão PBS-EDTA para as paredes do tubo cónico. Misturar suavemente e pipetar a suspensão de células remanescente na coluna. Repita 1x. Avance para o passo 2,8 utilizando as células não marcadas recolhidos no tubo cónico, depois de passar através da coluna. </li><li> Encher o tubo cónico contendo células não marcadas com PBS e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Adicionar 200 ul de tampão PBS-EDTA e gentilmente ressuspender as células. </li></ol> 3. Rotulagem de anticorpos e Preparação para separação de células <ol><li> Aspirar 1 ul de suspensão de células e colocar num tubo rotulado &quot;sem mancha&quot; (Passo 1.4). Adicionar 500 de tampão de EDTA-PBS e armazenar o tubo em gelo. </li><li> Adicionar 20ul de cada anticorpo (CD19, CD34 e CD45) por milhão de células em suspensão de células remanescente. Misturar bem e colocar o tubo no escuro durante 30 min à TA. Anticorpos CD são sensíveis à luz, execute as etapas 2-4 com as luzes apagadas. </li><li> Após 30 min de incubação com os anticorpos, aspirar 40 ul da suspensão de células e colocá-lo no tubo rotulado &quot;7AAD&quot;. Adicionar 1 ml de PBS para dentro do tubo e centrifugar a 500 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 100 uL de tampão de ligação. Adicionar 7 uL de 7AAD (7-Aminoactinomycin D) e incubar no escuro durante 10 min à TA. Durante o passo de incubação de 10 min completa 3.4. </li><li> Adicionar PBS para a parte superior do tubo contendo as células restantes marcadas com anticorpos de CD. Centrifuga-se o tubo a 500 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante, adicionar 500 ul de tampão PBS-EDTA e ressuspender o sedimento celular. Transfira a totalidade do volume de suspensão de células no tubo rotulado &quot;+ + +&quot;. A recuperação da totalidade da suspensão de células de umdd mais 1 ml de tampão de EDTA-PBS ao tubo cónico de 50 ml e de transferência para o tubo rotulado &quot;+ + +&quot;. </li><li> Após incubação (passo 3.3), adicionam-se 300 ul de tampão de ligação para dentro do tubo 7AAD. O &quot;imaculada&quot;, &quot;7AAD&quot; e &quot;+ + +&quot; e as amostras de &quot;34 +&quot;, &quot;45 baixo&quot;, &quot;45 med&quot; e &quot;altos&quot; tubos 45 estão prontos para a citometria de fluxo. </li></ol> 4. A classificação de células usando o citómetro de fluxo MoFlo XDP <ol><li> Set-up MoFlo para classificação: Alinhar lasers; estabilizar fluxo de gotículas; determinar atraso gota. </li><li> Prepare os controles de cor única compensação usando Invitrogen ABC Rato talão kit (ou similar) de acordo com as instruções do fabricante. Executar os controlos de cor individuais, ajustando as tensões dos canais de fluorescência para uma separação óptima das populações positivas e negativas. Definir coeficientes de compensação e aplicar parâmetro compensada para protocolo de coleta. Restabelece-se coeficientes de compensação de cada vez que um novo lote de anticorpo é obtido. </li><li> Criar protocolo incluindo lotes como se mostra na Figura 2. </li><li> Executar amostra sem manchas, definir tensão e ganho para dispersão de frente e de lado, e identificar negativos populações de fluorescência. Porque a recuperação do ADN é o objetivo do tipo, o limite deve ser definido baixa (≤ 1%), de forma que o DNA contendo detritos não contaminar as amostras recuperadas. * Certifique-se de que o sistema de evacuação Aerosol está funcionando em todos os momentos que vivem as células humanas estão sendo executados no MoFlo. </li><li> Executar uma pequena alíquota de + + + de amostra (~ 50.000 eventos) para definir a estratégia gating (Figura 2). Porque os progenitores de células B não dispersam de forma idêntica para amadurecer as células B, o CD19 backgate ungated + / CD34 + na população do FSC vs SSC a assegurar a delimitação de linfócitos inclui potenciais células pró-B. A partir dessa amostra também definir a população negativo de fluorescência para 7AAD. </li><li> Execute o exemplo 7AAD para determinar a viabilidade da amostra. Apenas as células de classificação a partir de uma amostra com alta viabilidade noinício (≥ 95%) como as células mortas vai manchar de forma indiscriminada e pode contaminar as populações de classificação. </li><li> Configure decisões de classificação para coletar quatro populações: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 baixa; CD19 + / CD34 - / med CD45 e CD19 + / CD34 - / CD45 alta. Incluir o linfócito e portões discriminação doublet nas decisões de classificação de todas as populações. </li><li> Para evitar obstruções na ponta de classificação, filtro + + + amostra através de um filtro de 40 um de células imediatamente antes da triagem e re-se qualquer filtro agregação ocorre na amostra durante a classificação. </li><li> Classificar as células para dentro de tubos de recolha (Passo 1.4) revestidas com FBS a 2% em PBS, em um suporte do tubo arrefecido com gelo ou embalado. </li><li> Imediatamente após a classificação é completada, extrair DNA. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

Autores têm nada a revelar.

O factor de maior impacto sobre o sucesso do protocolo é a presença de contaminação de detritos. Se solicitando sangue a partir de um banco de sangue do cordão umbilical, é importante para que o sangue fornecido como logo após a colheita quanto possível. Além disso, as amostras classificadas como linfocitose conter um maior número de linfócitos, no entanto, estes exemplos não têm um número suficiente de células B precursor e não devem ser usados. Para aumentar a probabilidade de se obter um número suficiente de células para cada um dos subconjuntos precursores É aconselhável começar com, pelo menos, 85 ml de sangue de cordão umbilical. É importante notar que, ao contrário dos adultos separações de sangue periférico, quando do fraccionamento de sangue de cordão umbilical a camada mononuclear é frequentemente contaminado com células vermelhas do sangue 12. Este protocolo inclui uma etapa de lavagem adicional para remover as plaquetas contaminantes. Protocolos descrevem separações mononucleares do sangue do cordão sugerem incluindo um passo de lise to Remover indesejadas células vermelhas. Não é recomendável este passo porque produz detritos contaminantes e tem um impacto negativo sobre o sucesso do tipo de célula. A fim de reduzir o número de células que têm de ser distinguidos através de citometria de fluxo que é necessário realizar um enriquecimento de células B antes da separação de células. O protocolo fornecido pela Miltenyi Biotec, que acompanha o kit de isolamento de célula B (B-CLL), foi optimizado para o sangue periférico, e recomenda o uso de 10 ul de B-CLL cocktail de anticorpos de biotina por cada 10 milhões de células. Este passo utiliza anticorpos contra CD2 (células T, células NK), CD4 (células T), CD11b (granulócitos, monócitos, macrófagos), CD16 (células NK; macrófagos; mastócitos), CD36 (plaquetas), CD235a (células eritróides) para esgotar as células não-B a partir do sangue do cordão umbilical. É importante a utilização do kit descrito e não o isolamento de células B kit II porque o kit primeiro contém um anticorpo contra CD43, que está presente em células pró-B. Durante a nossa optimization deste protocolo, verificou-se que um total de 40 ul de B-CLL cocktail anticorpo biotina é suficiente para produzir um resultado positivo tipo de célula. Além disso verificou-se que usando tão pouco como 5 pi mais do cocktail de anticorpos B-CLL biotina tinha efeitos adversos sobre o tipo de célula. Portanto, é altamente recomendável usar 40 ul de B-CLL cocktail de anticorpos biotina para o total de número de células mononucleares entre 175-250000000. Se começar com números mais baixos ou mais altos de células pode ser necessário para escalar os reagentes em conformidade. Há inúmeras publicações que descrevem conflitantes os marcadores que podem ser utilizados para distinguir sub-populações de células-B. A maior parte da discrepância pode ser explicada pelo facto de que a diferenciação é um processo contínuo e que a presença ou ausência de marcadores de superfície celular ocorre de forma gradual, em vez de numa maneira de tudo ou nada. Neste protocolo CD34 - / CD19 + e o nível de intensidade de CD45 + (expressão baixa, média e alta) foi utilizada para distinguir pré-BI, BII e pré-células B imaturas com um aumento no nível de expressão de CD45 correspondendo a progressão da diferenciação 6. Células pró-B, foram descritas por alguns como sendo CD19 + / CD34 + 13, enquanto outros têm mostrado que a pró-células B são CD19 - / CD34 + e células pré-BI são CD19 + / CD34 + 9,10. Com base nestas diferenças nós designamos os CD19 + / CD34 + como tardios células pró-B / BI iniciais pré-células. É importante notar que esta estratégia foi desenvolvida para isolar subconjuntos de precursor de células B que correspondem às células afectadas pela doença de leucemia linfoblástica aguda. No entanto, existem várias estratégias de triagem que podem ser empregues dependendo do subtipo de células de interesse. Anticorpo-fluorocromo combinações devem ser selecionados com base nas capacidades do seleccionador de células disponíveis. Como génerosl regra, a mais brilhante fluorocromo no seu painel deve ser usado para rotular o antígeno menos populoso e vice-versa. Na detecção de dupla manchadas de populações, especialmente eventos raros, como estes, gibão discriminação (Figura 2B) é uma parte vital da estratégia de aquisição electrónica. Isto assegura que os eventos de duplo-positivas são as células coradas verdadeiramente único com ambos os anticorpos e não meramente duas single-coradas células aderidas umas às outras. Alta velocidade, 4 vias de separação de células necessariamente cria um ambiente de aerossol controlada. Portanto, a classificação de células vivas humana deve ser feita com cautela. Diretrizes publicadas segurança e descontaminação estão disponíveis e devem ser revistos e aplicados antes de o tipo 14. Aprovação de Comitês Institucionais de Biossegurança ou seus equivalentes pode ser necessária antes da classificação. Para a descontaminação adequada após separação, lixívia deve ser adicionado ao recipiente de lixo para uma concentração final de 10%. Similarly, todos os tubos de amostras, bem como todas as superfícies na área imediata deve ser completamente descontaminado com uma solução de lixívia a 10%, recentemente feita. Em resumo, este protocolo proporciona uma estratégia para a obtenção de populações raras de precursor de células B e pode ser modificada para isolar uma população rara presente no sangue de cordão, incluindo as células estaminais hematopoiéticas e as células T imaturas. Recentemente, células B imaturas foram identificados no sangue periférico de indivíduos com VIH avançada 15. Por conseguinte, a utilidade deste método ultrapassa o estudo dos cancros do sangue. Finalmente, não foram ainda realizados isolamentos de RNA nas células de fluxo classificados, no entanto, este método deve ser adaptável com a ressalva de que, durante a separação de células das células deve ser seleccionada directamente em Trizol ou uma solução equivalente de ARN compatível, tal como o kit de RLT RNeasy disponível através da Qiagen.

De modo a identificar aberrações que estão presentes em doenças, é de vital importância que usamos tecidos saudáveis ​​ou células que correspondem ao tipo de tecido ou célula afectada pela doença. Uma razão para isso é que a variação epigenética entre tipos de tecidos é responsável por regular a expressão do gene e é crítica para a diferenciação celular durante 1,2 desenvolvimento humano normal. Uma segunda razão é que a regulação aberrante do tecido gene específico pode ter consequências para o desenvolvimento normal e é conhecida por contribuir para uma multiplicidade de estados de doença, incluindo o cancro. Assim, uma melhor compreensão de uma doença que envolve as células hematopoiéticas requer o conhecimento das células hematopoiéticas saudáveis. O desenvolvimento de células hematopoiéticas em medula óssea o produto através de uma ordem sistemática dos acontecimentos caracterizadas por alterações na expressão de marcadores de superfície celular 3. Estudos envolvendo participantes adultos têmmostrado que a medula óssea contém normalmente um número baixo de células B precursor de 4,5, ao passo que estudos envolvendo participantes pediátricos demonstraram que a percentagem de células B precursor é relativamente elevada em indivíduos com menos de 5 anos de idade 6. O sangue do cordão umbilical é usado como uma fonte de células-tronco hematopoiéticas no tratamento de distúrbios relacionados com o sangue e as doenças malignas, está prontamente disponível através dos bancos de sangue de cordão e é enriquecido para B imaturas e células T 7, que são as células alvo de várias doenças, incluindo a leucemia e linfomas. Precursor de células B na medula óssea têm sido extensivamente fenotipado 8,9 e pode ser definida pela presença de marcadores de células de superfície específicos que podem ser usados ​​para classificar essas células em subconjuntos distintos. Normais de células B procede de diferenciação através de uma série de fases da medula óssea que começam com as primeiras células pró-B e culminando em imaturas ou células B naïve. Segundoa van ZELM e colegas 10, células pró-B são caracterizados pela presença de CD34 e na transição para a fase 2 (Pre-BI) CD19 é adquirido. Células Fase 3 (Pré-BII) já não expressam o CD34 e começam a expressar IgM citoplasmática. Por último, uma característica essencial da fase 4 (imaturo células B) é a expressão de IgM de superfície. A estratégia de triagem descrito no presente protocolo foi descrito pela primeira vez por Caldwell e colegas 6 e inclui a utilização de apenas três marcadores de superfície das células o que reduz significativamente a complexidade e o custo de realizar as experiências de triagem de células. No seu trabalho, uma relação entre o CD45 e os estágios de diferenciação de células B foi estabelecida. Eles observaram que as células B na medula óssea, exibem níveis variáveis ​​de expressão de CD45. Especificamente, as células que expressavam níveis elevados de CD45 correspondendo a células que expressam IgM de superfície (células B imaturas), aqueles que expressaram um nível intermédio de CD45 correspondendo a células que expressavam cytoplasmic IgM (pré-BII células), e aqueles que expressaram baixos níveis de CD45 correspondendo a células que não expressaram IgM citoplasmática (pré-BI células). Este protocolo utiliza a estratégia desenvolvida por Caldwell e colegas 6 para isolar subconjuntos de precursor de células B a partir do sangue do cordão umbilical (Figura 1), que podem ser utilizados em ensaios a jusante que requerem ácidos nucleicos de elevada qualidade, tais como o ensaio de recuperação metilado CpG-island (MIRA ) 11 e quantitativos Os ensaios de PCR em tempo real. O método emprega uma separação inicial utilizando contas magnéticas para esgotar todas as células não-B do sangue do cordão umbilical e requer coloração com apenas 3 (anticorpos CD34, CD19 e CD45). As células que são recuperadas representam quatro estágios de diferenciação de células-B: 1) CD34 +; CD19 + (tarde) pro-B e no início pré-BI, 2) CD34 -, CD19 +; CD45 baixo (final pré-BI); 3) CD34 -, CD19 +; CD45 med (pré-BII) e 4) CD34 -; CD19 +; CD45 elevado (células B imaturas).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

O sangue do cordão umbilical é altamente enriquecida para células progenitoras hematopoiéticas em estágios diferentes de autorização de linhagem. Nós desenvolvemos um protocolo para o isolamento de células B precursor em quatro diferentes fases de diferenciação. Porque os genes são expressos e modificações epigenéticas ocorrer de uma forma específica de tecido, que é vital para discriminar entre tecidos e tipos de células, a fim de ser capaz de identificar alterações no genoma e o epigenoma que podem levar ao desenvolvimento de doença. Este método pode ser adaptado a qualquer tipo de célula presente no sangue do cordão umbilical, em qualquer fase da diferenciação. Este método compreende 4 passos principais. Primeiro, as células mononucleares foram separadas por centrifugação de densidade. Em segundo lugar, as células B são enriquecidas utilizando anticorpos conjugados com biotina que não reconhecem e remover as células B a partir de células mononucleares. Terceiros as células B são marcado por fluorescência, com anticorpos específicos de proteínas da superfície celular para as fases individuaisde desenvolvimento de células-B. Finalmente, as células marcadas por fluorescência são classificados e populações individuais são recuperados. As células são recuperadas da quantidade e qualidade suficiente para ser utilizado em ensaios de ácidos nucleicos a jusante.

Entre a amostra variação desempenha um papel importante no sucesso do tipo de célula (Tabela 1). As amostras com boas taxas de sucesso têm baixos níveis de contaminação de detritos (Figura 3A) e as amostras com índices de sucesso pobres têm níveis elevados de resíduos contaminantes (Figura 3B). Entre a amostra de variação pode ser um pouco controlado, se a amostra de sangue do cordão foram recolhidos em 24 hr de embarque (O / N prioritário). As células de fluxo classificados de cada precursor subconjunto de células B são da quantidade e qualidade suficientes para realizar isolamentos de ácido nucleico. O DNA isolado é de alta qualidade e podem ser usados ​​em análises de jusante. Rotineiramente, utilizam este DNA em MIRA 11 para enriquecer para o ADN metilado (Figura 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Cabo de Dados dos serviços de sangue </td><td> Ordenar pobres </td><td><strong&gt; Classificar Boa </td></tr><tr><td> Volume de sangue trabalhando com anticoagulante (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> White Blood Cells [10 3 / ul] </td><td> 8,68 </td><td> 11,19 </td></tr><tr><td> Linfócitos [10 3 / ul] </td><td> 3,88 </td><td> 3,76 </td></tr><tr><td> Linfócitos (%) </td><td> 44,70 </td><td> 33,6 </td></tr><tr><td> Os glóbulos vermelhos [10 6 / ul] </td><td> 3,65 </td><td> 3,05 </td></tr><tr><td colspan="3"> In-house Dados </td></tr><tr><td> Número de células depois de Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> Número de células após separação MACS </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Conde Eventos Total (MoFlo XDP) </td><td> 30,57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Viabilidade (%) </td><td> 98,00 </td><td> 98,00 </td></tr><tr><td> As células em Portão de linfócitos (%) </td&gt; <td> 17,00 </td><td> 50,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % Do total de eventos </td><td> 0,04 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> Eficiência </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 baixo </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % Do total de eventos </td><td> 0,05 </td><td> 0,13 </td></tr><tr><td> Eficiência </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % Do total de eventos </td><td> 1,54 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> Eficiência </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 alto </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % Do total de eventos </td><td> 6,2 </td><td> 10,25 </td></tr><tr><td> Eficiência </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Estatísticas celulares representativas de classificação. Linhas 1-5 são contagens fornecidos pela facilidade de sangue do cordão umbilical. As linhas restantes são dados coletados em nosso laboratório. O tipo pobre continha altos níveis de detritos e uma baixa percentagem de células no portão de linfócitos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figure 1. Fluxograma de processo. Sangue do cordão umbilical é processada e células mononucleares são isoladas usando Ficoll-Paque PLUS. Um passo de lavagem adicional é incluído para remover as plaquetas contaminantes. As células B são isolados a partir de células mononucleares utilizando o kit de isolamento de MACS da célula B humana (B-CLL). Este passo utiliza biotina-conjugados de anticorpos monoclonais (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE e CD235a) para remover todas as células não-B. Os recuperadas células B são marcadas com CD19-APC, CD34-PE e CD45-FITC de anticorpos então classificados usando o citómetro de fluxo MoFlo XDP para recuperar precursores de células-B subconjuntos: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 baixa ; CD19 + / CD34 - / CD45 med, e CD19 + / CD34 - / CD45 alto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Figura 2. Estratégia de propagação para a identificação e classificação de populations. setas vermelhas indicam o portão que é aplicada a trama subseqüente. Portões R4, R5, R6 e R7 indicam populações classificados. A) Encaminhar vs enredo lado dispersão mostrando enriquecido população de linfócitos. Portão, R1 linfócitos. B) Altura vs largura de dispersão para a frente para a identificação de células individuais contra doublets. R2, de porta única célula. C) CD19-APC células positivas cair em populações de células CD34-PE positivo e negativo. R3, CD19 + / CD34 - portão; R4, CD19 + / CD34 + portão população indicando tipo desejado d) CD19 + / CD34 - as células se dividem em três um pouco distintas CD45-FITC populações.. R5 e R6, CD19 + / CD34 - / CD45 baixo e CD19 + / CD34 - / CD45 populações med, respectivamente. R7, por causa do número de células altas na CD19 + / CD34 - / CD45 população elevada, esta porta tipo engloba somenteuma parte da população. Todas as células dessa população não precisa ser coletadas para análises a jusante. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Figura 3 a.) Níveis baixos de contaminação detritos após o enriquecimento da coluna. R1, barreira linfocitária. B) níveis elevados de contaminantes detritos após o enriquecimento da coluna. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Figura 4. Enriquecimento de DNA metilado em subconjuntos de células-B precursor. Uma DNA) sonicado isolado a partir de precursores de células-B subconjuntos é de alta qualidade. Para a construção da biblioteca de ADN é sonicada a uma média de 200-600 bp. Pista 1: Promega 100 bp ladder (catálogo # G2101), Pista 2: O ADN total isolado a partir de células CD19 + / CD34 +, Pista 3: O ADN total isolado a partir de células CD19 + </sse&gt; / CD34 - / CD45 células baixos; Pista 4: 100 ng de DNA isolado a partir de células CD19 + / CD34 - / CD45 células med; Pista 5: 100 ng de DNA isolado a partir de células CD19 + / CD34 - CD45 / células elevados. O DNA foi sonicado utilizando o Bioruptor Diagenode em alta durante um total de 9 min (30 seg ON; 30 seg OFF). O DNA foi purificado em coluna e visualizadas sobre um gel de agarose a 1% com SYBR green gel de ácido nucleico mancha. B) Após MIRA utilizando o Ultra ActivMotif MethylCollector kit, PCR com SLC25A37 (1-6) e APC1 (7-12) é realizada para confirmar enriquecimento de DNA metilado. 1 &amp; 7: ADN genómico foi sonicada (não MIRA), 2 &amp; 8: MIRA-CD19 + / CD34 DNA +, 3 &amp; 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 DNA baixo, 4 &amp; 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA; 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 DNA alta; 6 e 12: controle de água. Maior amplificação de SLC25A37 confirma o enriquecimento do ADN metiladoem subconjuntos de células-B precursor.

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Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Aqui descrevemos um protocolo para o isolamento de subconjuntos de precursor células B do sangue do cordão umbilical. A quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das células e usadas em ensaios subsequentes utilizando DNA ou RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K visualizações.  University of Missouri-Columbia. Aqui descrevemos um protocolo para o isolamento de subconjuntos de precursor células B do sangue do cordão umbilical. A quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das células e usadas em ensaios subsequentes utilizando DNA ou RNA.

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Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...