Este protocolo de localização in vivo de imunofluorescência, ou IVIL, avalia a biodistribuição in vivo de anticorpos diagnósticos e terapêuticos ou agentes baseados em anticorpos para pesquisa, detecção e tratamento do câncer. Em contraste com a coloração imunofluorescente convencional onde a expressão celular de antígenos é revelada ex vivo, o método IVIL elucida como anticorpos e agentes à base de anticorpos se distribuem no animal vivo. Este vídeo ajudará a entender o fluxo de trabalho global do método IVIL.
Ele mostra detalhes importantes para a reprodução bem sucedida do protocolo para outras aplicações e anticorpos. Observe os camundongos do modelo de câncer desejado para o crescimento adequado do tumor através da medição de palpação ou pinça antes de prosseguir. Purificar anticorpos de controle de isótipo de coelho anti-rato B7-H3 e coelho IgG em uma coluna de desalte para remover conservantes e buffers de armazenamento seguindo as instruções do fabricante.
Dosagens de 33 microgramas de cada anticorpo conjugado em tubos de microcentrifuuagem individuais. Após a anestesia, conforme descrito no protocolo de texto, prepare-se para a inoculação da veia traseira das soluções de anticorpos. Desinfete a cauda do animal limpando três vezes com um lenço de álcool.
Dilatar as veias da cauda aquecendo com uma almofada de calor por aproximadamente 30 segundos. Evite aquecer todo o animal. Usando um cateter de veias da cauda de calibre 27, insira a agulha borboleta em uma das duas veias laterais da cauda.
Visualize o fluxo sanguíneo no cateter para garantir que a agulha esteja bem colocada para que as soluções entrem totalmente no animal versus sejam capturadas na cauda. Use um pedaço de fita cirúrgica para fixar cuidadosamente a cauda com a agulha inserida ao palco. Lave o cateter com 25 microlitadores de soro fisiológico estéril tamponado com fosfato.
Em seguida, injete a solução de anticorpos no cateter usando seringas de insulina. Lave o cateter mais uma vez com 25 microliters de PBS estéreis. Retire a agulha da cauda e aplique pressão para parar qualquer sangramento.
Realize a eutanásia humana do mouse, conforme descrito no protocolo de texto, e coloque o rato na posição supina. Use tesoura cirúrgica e fórceps para extirir tecidos tumorais. Use fórceps para agarrar apenas a camada externa da pele entre o conjunto de glândulas mamárias mais próximas da cauda, e faça uma pequena incisão com um par de tesouras cirúrgicas.
Introduza a tesoura fechada no corte e abra lentamente a ponta para separar cuidadosamente a pele da membrana da parede abdominal subjacente, mantendo-a intacta. Faça uma incisão vertical no abdômen, continuando a separar a pele da membrana interna. Entre a terceira e quarta glândulas mamárias, faça um corte horizontal no abdômen para permitir a retração da pele e a visualização das glândulas mamárias.
Agarrando cada tumor ou glândula normal com fórceps, corte cuidadosamente a pele presa usando uma tesoura cirúrgica. Coloque tecidos excisados em moldes de base descartáveis de tecido que são pré-rotulados e preenchidos com temperatura de corte ideal incorporando meio. Congele rapidamente os moldes por colocação em gelo seco.
Para estudar a entrega fora do alvo, extirto outros tecidos ou órgãos de interesse. Usando um criostat, se sectionia blocos de tecido congelado com espessura de 10 mícrons e coloque seções adjacentes em lâminas de vidro de adesão pré-rotuladas. Enxágüe lâminas de tecido congelado com PBS de temperatura ambiente por cinco minutos para remover o meio de incorporação.
Demarcar seções teciduais com caneta de barreira hidrofóbica para reduzir o volume de soluções necessárias durante a coloração. Fixar as seções teciduais com solução de paraformaldeído de 4% por cinco minutos. Depois de enxaguar os slides em PBS por cinco minutos, permeabilize seções teciduais com 0,5% Triton X-100 em PBS por 15 minutos.
Enxágüe os slides novamente em PBS por cinco minutos. Bloqueie os tecidos com PBS contendo 3% de peso por volume de gógo bovino albumina e 5% de volume por volume de soro de cabra por uma hora à temperatura ambiente. Depois de enxaguar os slides em PBS por cinco minutos, incubar as seções com anticorpos primários que mantêm registros, como um marcador nuclear, vascular ou citoplasmista comum.
Aqui, o CD31 anti-rato de rato é usado em uma diluição de um a 100 na solução de bloqueio. Os slides com anticorpo primário são deixados durante a noite a quatro graus Celsius, protegidos da desidratação em uma bandeja de slides. Após a incubação, enxágue os slides em PBS por cinco minutos três vezes.
Mude o PBS cada vez. Incubar os slides com anticorpos secundários para rotular os anticorpos primários. Para esta aplicação, visualize o anticorpo anti-B7-H3 usando o anticorpo anti-coelho de cabra conjugado Alexa Fluor 546, e visualize CD31 com o anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 na solução de bloqueio.
Proteja os slides da luz e desidratação em uma bandeja de slides durante uma hora em temperatura ambiente. Depois de enxaguar os slides em PBS como antes, aplique uma gota do meio de montagem no centro da fatia de tecido. Coloque cuidadosamente uma mancha de cobertura, evitando a armadilha de bolhas de ar.
Sele as bordas da tampa com esmalte transparente e deixe secar. Proceder com imagens de microscopia confocal e análise quantitativa de imagem conforme descrito no protocolo de texto. Micrografias confocal representativas mostram a comparação de anticorpos B7-H3 específicos conjugados e isótipos não específicos de controle de anticorpos-ICG conjugados em glândulas mamárias murinas contendo tecidos normais ou carcinoma.
As glândulas mamárias murinas normais de um animal injetou intravenosamente com Iso-ICG ou B7-H3-ICG e contra-manchadas com CD31 não mostram nenhuma coloração dos conjugados de anticorpos. Os tecidos normais mostraram-se não ter expressão de B7-H3 pela coloração padrão de imunofluorescência ex vivo. Em tumores mamários invasivos, b7-H3-ICG se liga fortemente à vasculatura, o primeiro ponto de contato in vivo, e depois é capaz de extravasar da vasculatura para manchar heterogeneamente o epitélio tumoral.
Iso-ICG mostra acúmulo inespecífico dentro dos tecidos tumorais. A coloração imunofluorescente ex vivo padrão mostra expressão uniforme do marcador B7-H3 em células epiteliais e endoteliais. Micrografias confocal representativas mostram o método de localização da imunofluorescência in vivo para detectar expressão de netrin-1 ou expressão de controle isótipo em carcinoma murino e glândulas mamárias normais.
A localização da imunofluorescência in vivo confirma o sinal epitelial para netrin-1 em tumores MMTV-PyMT, mas não em glândulas mamárias normais. Além disso, há um forte sinal netrin-1 nas células endoteliais em tumores mamários, como indicado pelo sinal amarelo colocalizado. O sinal é significativamente mais fraco nas glândulas mamárias normais.
O método IVIL precisará ser otimizado em termos de dosagem de anticorpos, tempo de coleta de tecidos e diluição de anticorpos secundários para implementação bem-sucedida. O IVIL permite o direcionamento de epítopos conformais que não podem ser detectados usando a coloração padrão da imunofluorescência, que requer processamento tecidual. Além disso, órgãos saudáveis de camundongos portadores de tumores podem ser coletados para avaliar a entrega fora do alvo de anticorpos terapêuticos.
Com o aumento do uso de terapêuticas baseadas em anticorpos e agentes de contraste na pesquisa e gerenciamento do câncer, o método IVIL é altamente aplicável à pesquisa e desenvolvimento farmacêutico. Pesquisadores em terapias contra o câncer, imagem molecular, inflamação e outras áreas podem descobrir que o método IVIL fornece informações úteis.
