Os endocanabinóides são mediadores lipíduos conservados que regulam múltiplos processos biológicos em uma variedade de organismos. Os primeiros endocanabinóides descobertos são anandamida e 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. O nematode C.elegans é um poderoso modelo animal para estudar uma grande variedade de processos biológicos.
Recentemente, descobrimos que a 2-AG desempenha um papel fundamental na regulação do tráfico de colesterol em C.elegans. É por isso que tornou-se imperativo projetar e otimizar um método para estudar o 2-AG endógeno por meio da detecção e quantificação em C.elegans. Métodos analíticos relatados anteriormente para quantificar 2-AG em amostras biológicas geralmente envolvem o uso de padrões deutados que são adquiridos comercialmente são necessários para tê-los disponíveis para compra.
No entanto, eles são caros, e devido à presença de múltiplos títulos duplos, são sensíveis a serem oxidados ao longo do tempo. A versão mais comum dos padrões baseia-se no ácido aracidonico octadeuterado adequado para quantificação por diluição de isótopos, por cromatografia líquida e espectroscopia de massa posterior. Para superar as dificuldades associadas ao custo e estabilidade das normas deuteradas para quantificar o 2-AG, utilizamos um método conveniente e simples para preparar um padrão analítico baseado no deutério-5-glicerol.
A sequência para preparar o padrão pendeuterado requer um procedimento de três etapas. Sendo possível ser mantido na forma protegida até que seja necessário. O principal objetivo deste trabalho é mostrar um método completo para estudar 2-AG em C.elegans desde a síntese do padrão de deutado analítico até a preparação e extração das amostras de nematoides e, finalmente, a análise por cromatografia líquida e espectroscopia de massa.
Para obter 1-AG desuterado como padrão interno desuterado para ensaios de quantificação, siga um protocolo de três etapas. A fim de proteger apenas os álcoois primários, primeiro adicione 38 miligramas de glicerol deutado a um tubo de reação de 10 mililitros usando uma pipeta Pasteur e adicione um agitador magnético. Em seguida, adicione cinco mililitros de DCM anidro usando uma seringa Hamilton de cinco mililitros e encha o tubo com nitrogênio seco para dar uma atmosfera inerte.
Prepare um banho usando um frasco raso de Dewar cheio de acetato de etila destilado. Encha o tubo de reação hermeticamente fechado dentro do banho e esfrie-o lentamente adicionando nitrogênio líquido ao acetato etílico até que o solvente esteja congelado. Cuidado, o líquido ferve violentamente à temperatura ambiente e pode causar queimaduras graves se estiver em contato com os olhos e a pele.
Em seguida, adicione 54 miligramas de colisão anidro usando uma seringa Hamilton. Cuidado, colisão é volátil e tem um cheiro muito forte e desagradável. A 70 miligramas de terbutil-dimetil-cetilcloroide e mexa tudo por três horas a menos 78 graus em um agitador magnético.
Adicione dois mililitros de salmoura para saciar a reação. Extrair a solução com dois mililitros de diclorometano destilado três vezes usando um funil separado mantendo os extratos orgânicos cada vez. Em seguida, misture os três extratos orgânicos e seque sobre sulfito de sódio.
Purifique a mistura bruta por cromatografia de coluna usando gel de sílica como fase estacionária e um gradiente de acetato de hexano a partir de 100% de hexano e acabamento com acetato etílico 100%. Para esta etapa de esterificação, adicione 10 miligramas do produto previamente declarados a um tubo de reação de 10 mililitros usando uma pippette Pasteur e adicione um agitador magnético. Adicione dois mililitros de DCM anidro usando uma seringa Hamilton de cinco mililitros e encha o tubo com nitrogênio seco para dar uma atmosfera inerte.
Esfrie a solução a zero graus usando um banho de gelo. Ad 36 miligramas de ácido aracidônico usando uma micropipette ajustável multi-volume e mexa. Em seguida, adicione 15 miligramas de 40-metil-aminopirida e mexa.
Adicione 15 miligramas de diacylpropylcarbodiimid usando uma micropipette ajustável de vários volumes e mexa. Adicione dois mililitros de água para saciar a reação e, em seguida, extrair a solução com dois mililitros de DCM destilado três vezes usando um funil separador. Combine os três extratos orgânicos e seque sobre sulfite de sódio, purifique a mistura bruta por cromatografia de coluna usando gel de sílica como fase estacionária, depois 10% aumentando o gradiente de acetato de etila de hexano a partir de 100% de hexano e terminando com acetato de etila de hexano de 50%.
Finalmente, para a etapa de desproteção, adicione 15 miligramas do produto previamente sintetizado a um tubo de reação de 10 mililitros usando uma pipeta Pasteur e adicione um agitador magnético. Adicione dois mililitros de tetrahidrofurano anidrofurano usando uma seringa Hamilton de cinco mililitros e encha o tubo com nitrogênio seco para dar uma atmosfera inerte. Em seguida, esfrie a solução a zero graus usando um banho de gelo.
Adicione 150 microliters drop-wise de uma solução molar de flúor de tetrabutylammonium em THF usando uma seringa Hamilton. Depois de uma hora, adicione dois mililitros de água para saciar a reação. Extrair a solução com dois mililitros destilados DCM três vezes usando um funil separador.
Misture os três extratos orgânicos e seque sobre sulfito de sódio. Para o procedimento de branqueamento, gire os vermes em placas de NGM semeadas de seis centímetros. Permita que o verme cresça de dois a três dias para que haja muitos ovos e adultos gravid no prato.
Uma vez que você tenha muitos ovos e adultos, despeje cinco mililitros de M9 no prato. Usando uma pipeta de vidro, transfira os vermes para um tubo falcão de 15 mililitros. Centrifugar o tubo por dois minutos a 2.000 G e pelotar os vermes.
Sucção a maior parte do M9 sem perturbar a pelota de verme. Adicione três mililitros de solução de branqueamento e misture a solução suavemente invertendo por aproximadamente cinco minutos ou até que você veja uma diminuição no número de vermes adultos intactos. Uma vez que a maioria dos corpos tenham dissolvido, centrífuga a 2.000 G por um minuto.
Sucção a maior parte da solução de branqueamento sem perturbar a pelota de verme. Adicione 15 mililitros de M9 ao tubo e misture bem. Centrífuga novamente a 2.000 G por um minuto.
Sucção a maior parte do M9 sem perturbar a pelota de verme. Para a preparação da amostra de vermes, deixe os embriões N2 obtidos pelo procedimento de branqueamento terem durante a noite no tampão M9 a 20 graus. Em seguida, colher L1s sincronizados por centrifugação do tubo dois minutos a 2.000 G.Lave os worms com tampão M9 mais uma vez e quantifique o número de L1 vivo. Semente aproximadamente 10.000 vermes em placas de NGM com um mililitro de OP 50 Escherichia coli previamente seca.
Incubar as placas pelo menos por 48 horas a 20 graus até que os vermes cheguem ao estágio L4. Colher os vermes usando tampão M9 frio em um tubo falcão de 50 mililitros. Lave-os mais uma vez e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitros.
Pelota os vermes por centrifugação a 2.000 G por um minuto. Elimine a maioria dos supernaspentes. Em seguida, mergulhe o tubo em nitrogênio líquido e mexa a menos 80 graus.
Descongele aproximadamente 100 microliters de pelotas de vermes congelados pertencentes ao N2 e adicione 1,3 mililitros de metanol. Depois disso, sonicar a amostra por quatro minutos. Após a sônicação, adicione 1.000 ppb do padrão desuterado interno, 2,6 mililitros de clorofórmio e 1,3 mililitros de 0,5 molar de cloreto de potássio, 0,08 molar de ácido fosfórico para uma razão final de um para um.
Vórtice as amostras por um minuto e, em seguida, sonicá-las em um banho de água ultrassônica por 15 minutos no gelo. Vórtice as amostras novamente por um minuto e centrifuá-las por 10 minutos a 2.000 G para induzir a separação de fase. Colete a fase inferior em um tubo de vidro limpo, seque-o sob nitrogênio, e resuspenque-o em 100 microliters de acetonitrilo.
Para obter uma quantificação bem sucedida do endógeno 2-AG, foi necessário sintetizar seu analógico saturado usando um método de três etapas. Posteriormente, foi adicionado a amostras de vermes, extraídos e analisados por cromatografia líquida de alto desempenho, acoplado à espectrometria de massa. Usado como padrão interno, o 1-AG deuterado sintético foi a ferramenta para quantificar o metabólito endógeno.
O método foi otimizado utilizando-se as transições para 2-AG e para 1-AG desutado onde moléculas de glicerol são perdidas. 2-AG endógeno das amostras de C.elegans foi detectado com sucesso e quantificado por diluição isotópica com o deuterizado quimicamente 1-AG usando cromatografia líquida de alto desempenho acoplado à espectrometria de massa. A amostra um foi preparada com o padrão deuterado 1-AG, enquanto a amostra dois sem o padrão.
Uma vez que a concentração original de padrão desutado na amostra um e três foi de 1.000 ppb cada, a partir da razão de pico de área é possível calcular a concentração endógena de 2-AG na amostra de 340 ppb para amostra um e 360 ppb para a amostra três, dando uma média de 350 ppb. As razões foram calculadas como qualidade entre as áreas de pico de 2-AG e deuterados 1-AG, respectivamente, para duas amostras isoladas. Ambos com o padrão deuterado adicionado anterior à extração.
Dada a importância recentemente descoberta do 2-AG no aprimoramento do tráfico de colesterol e a falta de informação de como os lipídios influenciam esse processo, foi necessário um método de detecção confiável para este endocanabinóide. O desenvolvimento bem-sucedido de um método sintético simples e robusto relatado aqui para obter 2-AG analógico deuterado foi um passo fundamental deste protocolo. A maioria dos métodos relatados para quantificar monoacylglicerols envolve o uso de padrões analíticos comercialmente disponíveis, que geralmente são caros e instáveis em condições regulares de armazenamento, tornando-os inalcançáveis para laboratórios de menor orçamento.
No entanto, este método resolve isso propondo uma síntese do padrão utilizando materiais de partida mais acessíveis. O método sintético é direto sem condições sofisticadas necessárias, tornando-o ideal para ser realizado em qualquer laboratório com equipamento mínimo e acesso a reagentes, mesmo com orçamento reduzido. Em resumo, este novo procedimento descreve uma maneira direta e reprodutível de detectar e quantificar 2-AG que ajudará a responder algumas das questões levantadas após a descrição do papel desses endocanabinóides no tráfico de colesterol em C.elegans.
