A coenzima A, chamada CoA para abreviar, é um importante cofator no metabolismo celular. Medições quantitativas revelam alterações que acontecem com estados nutricionais e hormonais em modelos animais. Este método quantifica a quantidade total de CoA celular, incluindo derivados de CoA e CoA gratuito, em um método simples e confiável.
Vários tipos de neurodegeneração com acúmulo de ferro cerebral estão associados a mutações nos genes da via biossintética coa. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema biológico, uma vez que todos os organismos requerem CoA para sobrevivência, crescimento e função. Um pesquisador iniciante pode lutar com os primeiros passos na preparação da amostra, onde é importante manter as amostras absolutamente frias e, em seguida, transferi-las rapidamente para hidróxido de potássio.
Limitar o número de amostras em um lote antes da transferência para hidróxido de potássio e praticar com a transferência antes de trabalhar com as amostras experimentais. Muitos pesquisadores não estão familiarizados com a extração em fase sólida na preparação de amostras biológicas para análise bioquímica posterior. Para começar, incubar pratos de cultura triplicada em paralelo, dois para análise bioquímica e um para determinação de número celular viável.
Quando a cultura se aproxima das densidades subconfluentes tardias, por exemplo, as células HepG2/C3A humanas cresceram a uma densidade de seis a oito vezes 10 para as seis ou hek 293T cultivadas a uma densidade de cerca de 1,3 vezes 10 a sete por prato de 100 milímetros, colher as células aderentes na cultura. Em seguida, adicione um mililitro de água gelada ao mesmo prato de cultura. Raspe as células na água fria do prato, e transfira a suspensão celular para um tubo de ensaio de vidro contendo 400 microliters de hidróxido de potássio de 0,25-molar e 1,5 mililitros de água para trazer o pH acima de 12.
Misture a suspensão vigorosamente por vórtice em alta por 10 segundos. Em seguida, cubra firmemente com filme de parafina, e incubar a 55 graus Celsius por uma hora sem tremer em um banho de água. Em seguida, adicione 160 microliters de solução trizma-cloridrato de um molar e 10 microliters de 100 mililitros mBBr.
Misture por vórtice no alto por 10 segundos. Isso leva o pH a aproximadamente oito para suportar a reação mBBr com CoA gratuito. Cubra o tubo com filme de parafina, e incubar as amostras à temperatura ambiente por duas horas no escuro para que o mBBr reaja com o tiol de CoA.
Depois de duas horas, adicione 100 microliters de ácido acético, e misture por vórtice por 10 segundos para parar a reação. Uma precipitação se forma no tubo. Em seguida, centrífuga a 2.000 vezes g por 15 minutos.
Para remover os detritos celulares precipitados, transfira e salve o sobrenante em um tubo de teste de vidro para a limpeza da coluna de extração em fase sólida. Antes de iniciar a análise, adicione dois mililitros de hidróxido de potássio de um milimão a um tubo de teste de vidro projetado para inserção de uma sonda e ruptura tecidual com um homogeneizador rotor-estetor. Mantenha o tubo no gelo até usar.
Pesar os pedaços de tecido congelado rapidamente, e registrar o peso molhado para cada amostra. Transfira o tecido para o tubo de vidro e homogeneize o tecido por 30 segundos. Evite o degelo completo do tecido.
Adicione 500 microliters de hidróxido de potássio de 0,25 molar. Vórtice no alto por 10 segundos, e mantenha no gelo. Isso traz o pH da amostra acima de 12 para hidrolisar os tioestres coa para produzir CoA total.
Cubra o tubo com filme de parafina. A preparação de células cultivadas e a preparação dos tecidos são os passos mais críticos neste procedimento. É importante adicionar hidróxido de potássio elevado rapidamente para evitar a degradação do CoA.
Incubar as amostras a 55 graus Celsius por duas horas em um banho de água sem tremer para suportar a hidrólise. Em seguida, adicione 150 microliters de um molar Trizma-cloridrato e 10 microliters de 100 milimil mBBr para trazer o pH para cerca de oito para suportar a reação mBBr com CoA livre. Vórtice no alto por 10 segundos.
Cubra o tubo com filme de parafina e incuba as amostras à temperatura ambiente por duas horas no escuro para garantir que todo o CoA seja derivado com mBBr. Depois disso, adicione 100 microliters de ácido acético, e vórtice no alto por 10 segundos para parar a reação. Centrífuga a 2.000 vezes g por 15 minutos para pelotas detritos celulares precipitados, e transfira o supernasal em um tubo de teste de vidro para a limpeza da coluna de extração em fase sólida.
À temperatura ambiente, equilibre cada mililitro descartável 2-2-piridyl-coluna de gel de sílica etil com um mililitro de tampão de lavagem para garantir que o grupo funcional piridilo seja protoado e funcione como um trocador de ânion. Em seguida, pipete a amostra sobrenatante na coluna, e coletar o elunato. Lave a coluna duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem e uma vez com um mililitro de água para remover qualquer espécie não retida.
Em seguida, em um tubo de ensaio de vidro separado, lave a coluna duas vezes com um mililitro de tampão de elução para coletar o CoA-bimane. Seque a amostra de CoA-bimane no tubo sob gás nitrogênio. Veda, cubra completamente o tubo, e armazene a menos 20 graus Celsius.
Quando estiver pronto para a análise do HPLC, resuspenja a amostra em 300 microliters de água e misture vigorosamente com vórtice no alto por 10 segundos. Transfira a amostra resuspended para um filtro de tubo de centrífuga e centrífuga a 5.000 vezes g por 10 minutos para remover qualquer precipitante. Em seguida, transfira a amostra filtrada para um frasco de vidro adequado para injeção HPLC.
Neste estudo, um perfil hplc representativo mostra o tempo de retenção do padrão CoA-bimane na coluna C18 HPLC. Quantidades crescentes do padrão CoA-bimane foram injetadas individualmente, e as áreas sob os picos nos cromatógrafos CoA-bimane foram plotadas em função da entrada CoA-bimane. A curva padrão refletiu a magnitude da absorção de CoA-bimane em um comprimento de onda de 393 nanômetros.
A fluorescência do CoA-bimane também foi refletida no comprimento de onda de excitação de 393 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 470 nanômetros. A separação subsequente do HPLC e os perfis típicos de detecção para fígado de rato ou células C3A cultivadas humanas são indicados aqui por picos vermelhos, com um tempo de retenção entre 11 e 12 minutos usando o programa de elução. Se a reação com o mBBr não produzir resultados detectáveis, a quantidade de Trizma-HCl pode precisar ser ajustada para reduzir o pH para aproximadamente oito.
É possível detectar moléculas celulares adicionais que contenham moieties de sulfhydryl ou tioester como derivados de bimane. Por exemplo, glutationo-bimane pode ser detectado com o método HPLC. Essa técnica permitirá que outros pesquisadores investiguem o papel potencial da disfunção do CoA associada ao desequilíbrio metabólico, como modelos animais de diabetes tipo 2.
Os pesquisadores devem usar equipamentos de proteção individual ao trabalhar com solventes orgânicos usados para a extração em fase sólida.
