O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento de redes de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidas pelo homem em placas de MEA multiwell para eletroporar reversivelmente as membranas celulares para medidas potenciais de ação. Parâmetros potenciais de ação podem então ser usados para gerar essas curvas de resposta para testar compostos para eletrofisiologia. A codificação Multiwell MEA e o revestimento de células são os passos mais desafiadores que precisam de atenção especial.
Deve-se executar essas etapas diligentemente e rapidamente para evitar que gotículas se espalhem e sequem. Com a prática, isso pode ser facilmente superado. Desenvolvemos uma interface de usuário gráfica personalizada para segmentação única, garantia de qualidade e extração de parâmetros.
Nosso robusto fluxo de trabalho MATLAB foi implementado para reduzir rapidamente grandes volumes de dados experimentais brutos em um agrupamento imparcial de formas de onda potenciais de ação. Comece descongelando cardiomiócitos pluripotentes induzidos pelo homem de acordo com as instruções do manuscrito. Suspenda suavemente as células usando uma pipeta de transferência para dissociar aglomerados celulares.
Em seguida, distribua cuidadosamente dois mililitros de suspensão celular em cada poço de uma placa de seis poços revestida de substrato e coloque a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. As células devem aderir aos tratos de gel por 24 horas e bater espontaneamente em 48 horas após o revestimento. Dois dias antes do revestimento adicionar 0,5 mililitro de cultura de cardiomiócito iPSC humano meio para cada poço de uma matriz multi-eletrodo de 24 poços, ou placa MEA, e realizar uma gravação de linha de base para verificar a relação sinal-ruído como uma verificação de qualidade dos MEAs.
Em seguida, aspire a mídia, enxágue os poços com água estéril e esterilizar sob uma luz UV em um capô de fluxo laminar durante a noite. No dia seguinte, adicione 0,1 mililitro de FBS a cada poço para tratamento hidrofílico das superfícies de MEA e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, aspire o FBS, e enxágue cada poço duas vezes com 0,5 mililitros de água estéril.
Deixe a placa secar no capô de fluxo laminar durante a noite. No dia seguinte, pipeta cinco microliters de diluição de fibronectina de trabalho e distribuem cuidadosamente a gota no centro de cada poço para cobrir todos os 12 eletrodos. Coloque imediatamente a placa em uma superfície elevada dentro de uma câmara umidificante contendo água estéril suficiente para cobrir toda a superfície do prato.
Coloque a câmara com a placa na incubadora de cultura celular por três horas e, em seguida, proceda com revestimento celular. Quando estiver pronto para emplacar os cardiomiócitos, ajuste a densidade celular para 6.000 células por microlitera, diluindo-as no meio de descongelamento do cardiomiócito iPSC humano. Use movimentos suaves para evitar que as células se sedimentem.
Leve a placa MEA para dentro da coifa de fluxo laminar e remova cuidadosamente a gota de fibronectina com uma pipeta P10 sem tocar nos eletrodos. Dispense imediatamente uma gotícula de célula de cinco microliter para o centro do poço certificando-se de cobrir todos os 12 eletrodos. Faça este bem de cada vez para evitar que a fibronectina seque.
Quando terminar o revestimento, coloque a placa MEA de volta na câmara umidificante vagamente coberta e devolva-a à incubadora de cultura celular por três horas. Após a incubação, use uma pipeta P200 para adicionar cuidadosamente 200 microliters de cardiomiócitos iPSC humanos descongelando meio para cada poço sem perturbar as células. Coloque a placa MEA de volta na incubadora de cultura celular e substitua o meio de cultura 24 horas após o revestimento.
Quando estiver pronto para adquirir sinal dos cardiomiócitos, inicie o software de aquisição e insira a placa MEA de acordo com as instruções do manuscrito. Clique no botão Explorar para visualizar o sinal em todos os poços e verificar a qualidade do sinal em condições de estado constante. Tome notas sobre eletrodos com potencial de campo, ou FP, sinais na faixa de milívoltos.
Em seguida, clique no mesmo botão para impedir a exploração. Nenhum dado foi registrado até agora. Clique no botão Ir para começar a gravar.
Os eletrodos em cada poço mostrarão sinais FP na janela de dados brutos. Após 30 segundos de gravação, clique no botão Estimular e permitir que a eletroporação ocorra nos locais selecionados por 30 segundos. Em seguida, clique no mesmo botão para interromper a simulação e continue gravando por 60 segundos.
Use o software personalizado baseado em MATLAB para segmentar e extrair vários parâmetros potenciais de campo e de dados potenciais de ação. Primeiro, execute o código de análise de forma de onda e clique em Arquivo e selecione Process.h5. Encontre e selecione o mwd criado anteriormente.
arquivo h5. Clique no botão Salvar diretório para alterar o local de armazenamento dos arquivos de saída. Em seguida, crie uma fila de processamento de sinal selecionando o eletrodo e as combinações de poços de interesse e, em seguida, clicando no botão Fila.
Repita esta etapa para adicionar mais eletrodos e combinações de poços à fila. Se as células foram tratadas com drogas, a fila pode ser editada clicando diretamente em Med Name, Med Concentration. Uma vez que a fila tenha sido finalizada, clique no botão Initialize Waveforms, que iniciará o processamento preliminar onde os sinais são identificados e extraídos para segmentação.
Quando o processamento estiver concluído, clique no botão Zoom In e selecione o potencial de ação, ou AP, área de interesse. Clique no botão Manter e revise os painéis. Os picos e cochos são detectados para cada forma de onda, e os APs normalizados são sobrepostos.
Quando terminar, clique no botão Manter para passar para o próximo traço na fila e repita o processo para o resto dos sinais de combinação de eletrodo e poço. A viabilidade e densidade de revestimento dos cardiomiócitos pós-descongelados é fundamental para a cultura MEA multiwell. O revestimento adequado resulta em uma cultura monocamada saudável com espancamento espontâneo em 48 horas, enquanto a má viabilidade celular resulta em culturas com uma alta porcentagem de populações não miótida.
A dispersão de gotículas celulares afeta a densidade cultural e pode até levar à morte celular, por isso a colocação precisa das células é importante. As células cultivadas em MEAs são submetidas a uma verificação de qualidade para atividade elétrica 48 horas após o revestimento. Se 50% dos eletrodos dentro de uma rede e 70% do total das redes não produzem sinais FP, então a cultura é subótima.
Gravações AP mediadas por eletroporação podem ser obtidas várias vezes 48 horas após o revestimento MEA. Múltiplas eletroporações do mesmo local celular a zero, 24, 48, 72 e 96 horas não têm efeito significativo na forma AP ao longo do tempo. Além disso, não foi observada correlação entre as amplitudes AP de FP e pós-eletroporação do mesmo local celular.
Uma vantagem significativa deste método é que a placa MEA multiwell pode ser reutilizada várias vezes. Para demonstrar a confiabilidade deste array, as formas de onda AP de 3.815 SÃO retiradas de três lotes de restauração e os dados de duração de AP são extraídos para examinar a repetibilidade dos resultados. Quando de interesse, é possível realizar ensaios adicionais, como expressão genética, medidas transitórias de cálcio e grampo de remendo para investigar o comportamento de correntes iônicas específicas.
Essa técnica abre caminho para os pesquisadores melhorarem a maturação eletrofisiológica, bem como para testar efeitos de dose crônica nos cardiomiócitos.
